未分化细胞检测方法及复合糖检测方法技术

本发明专利技术的目的是提供使用培养了干细胞的培养上清液评价细胞的分化状态的方法。本发明专利技术中，能够提供包含“Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc”或“Fucα1-2Galβ1-3GalNAc”的糖链结构的“未分化糖链标志物”，其能够使用干细胞的培养上清液以高灵敏度判定干细胞的未分化状态。同时，发现能够以高灵敏度识别该“未分化糖链标志物”的BC2LCN凝集素或其变体是能够以培养上清液来判定细胞的未分化状态的、优秀的“未分化糖链标志物检测用探针”。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】未分化细胞检测方法及复合糖检测方法
本专利技术涉及使用细胞培养上清液来判定细胞的状态的方法。特别地，涉及评价未分化细胞的存在、不存在的方法。另外，本专利技术涉及检测糖蛋白质等具有糖链的检测对象物质的方法。
技术介绍
多能干细胞因其能够分化为构成机体的所有细胞的性质以及能够维持其未分化性的性质而获得关注，不仅限于创新药物筛选或阐明疾病机理的应用，而且在世界范围内正将其作为再生医疗的材料进行研究。2010年世界上首次利用人ES细胞的第1期临床试验在美国针对急性脊髓损伤开始展开，进而，针对视网膜变性疾病的使用人ES细胞的第1/2期临床试验的新药临床试验申请(IND)被FDA批准，利用人多能干细胞的再生医疗研究正在持续飞跃性发展。特别地，日本发现的作为新的人多能干细胞的iPS细胞因为不使用受精卵等理由故而伦理障碍较低，并且具有能够从自体组织建立这样的极大的优点，再生医疗临床界也对其充满期待。在日本，物理化学研究所发生·再生科学综合研究中心及先端医疗中心等计划从2013年开始以老年黄斑变性症患者为对象使用iPS细胞进行临床研究，庆应大学也有2015年开始对脊髓损伤患者进行临床研究的方针。由此，虽然ES细胞、iPS细胞这类人多能干细胞的临床应用已被展开，但关于确保品质和安全性地供给细胞的体制尚未准备充分。对多能干细胞而言，制造方法、培养条件、保存条件等对未分化性、分化能力、增殖能力等品质产生影响。因此，如果不基于适当的方法进行管理，则有产生因生产者、使用者而异的结果的可能性。这是干细胞治疗的可靠性较低、及招致因为治疗导致发生健康损害等的弊端的原因。因此，可靠性和再现性高的维持培养法及计测·评价系统是必需的。例如，细胞治疗中，多能干细胞并非原样使用，而是分化为目标细胞之后用于移植，但在分化为目标细胞的细胞源中混入了未分化的细胞时，有报道称该未分化细胞将是肿瘤形成的原因。因此，需要开发对细胞治疗中使用的细胞中是否混入了未分化细胞即肿瘤形成细胞进行评价的技术。另一方面，成体干细胞的种类和特性较之ES细胞、iPS细胞这类人多能干细胞而言更加多种多样，其在临床中的应用已作为既有技术存在。但是，稳定获得品质适于移植的细胞并不容易，因此确立充质干细胞的品质验证方法以及基于此确立稳定的培养方法一直是极其重要的课题。此外，即使在进行了对利用成体干细胞的细胞移植的有效性的评价、对其机制的理解及风险评价的基础上，仍需要开发对移植前的细胞的品质验证方法。本专利技术的专利技术人等以前使用了凝集素微阵列，对从五种不同的体细胞(皮肤、胎儿肺、子宫内膜、胎盘动脉、羊膜)制作的人iPS细胞(114份检测样本)和人ES细胞(9份检测样本)的糖链情况进行了广泛的分析。结果发现，尽管最初的体细胞随组织不同而具有各异的糖链情况，但制作的iPS细胞均显示出基本相同的糖链情况，通过导入重编程基因而均收敛为与ES细胞类似的糖链结构。对人ES·iPS细胞与人体细胞的凝集素阵列数据进行了详细的分析，根据分析结果，推定未分化的人ES·iPS细胞较之体细胞而言α2-6Sia、α1-2Fuc、1型LacNAc的表达量显著增加。进而，通过利用了DNA阵列的糖转移酶基因的表达分析以及利用质谱仪的方法，发现rBC2LCN仅与未分化的人ES·iPS细胞结合(非专利文献1)。上述rBC2LCN是使BC2LCN凝集素(YP_002232818)(其对应于来自革兰氏阴性菌(洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderiacenocepacia))的BC2L-C蛋白质的N末端结构域)在大肠杆菌转化体中表达而得的重组体，其为识别复合糖链的非还原末端的“Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc”以及“Fucα1-2Galβ1-3GalNAc”的糖链结构的凝集素(非专利文献1、3)。本专利技术的专利技术人等在利用上述凝集素阵列的实验中，发现rBC2LCN虽然与未分化的人ES·iPS细胞反应，但与分化了的体细胞(皮肤、胎儿肺、子宫内膜、胎盘动脉、羊膜)完全不反应。认为rBC2LCN与具有“α1-2Fuc”、“1型LacNAc”及“α2-6Sia”中的两个(α1-2Fuc、1型LacNAc)的“Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc(＝H1型结构)”及“Fucα1-2Galβ1-3GalNAc(＝H3型结构)”的糖链结构特异性反应。这两个糖链结构在人ES·iPS细胞中高表达，并且是在分化了的皮肤、胎儿肺、子宫内膜、胎盘动脉、羊膜的细胞中几乎不表达的糖链。因此显示，rBC2LCN识别的糖链配体为未分化细胞特有的新颖的未分化糖链标志物，并且显示，rBC2LCN可用作针对该未分化糖链标志物“Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc”和/或“Fucα1-2Galβ1-3GalNAc”(下文中有时将二者合称为“Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc”)的特异性探针。这之后，Drukker等人的团队也发现，识别“Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc”的抗体能识别未分化状态的ES细胞及iPS细胞(非专利文献2)，证实了本专利技术的专利技术人的上述发现。但是，Drukker等人的上述抗体虽然与“Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc(＝H1型结构)”特异性反应，但与“(Fucα1-2Galβ1-3GalNAc＝H3型结构)”不反应。与rBC2LCN比较而言，其不能检测未分化细胞中的“Fucα1-2Galβ1-3GalNAc”或“含有Fucα1-2Galβ1-3GalNAc的糖链”，故而较之本专利技术的专利技术人的rBC2LCN而言存在灵敏度不够充分的缺点。专利文献1：日本特开平9-301995号专利文献2：WO2007/027495非专利文献1：TatenoH,ToyotaM,SaitoS,OnumaY,ItoY,HiemoriK,FukumuraM,MatsushimaA,NakanishiM,OhnumaK,AkutsuH,UmezawaA,HorimotoK,HirabayashiJ,AsashimaM.,JBiolChem.2011,286(23):20345-53.非专利文献2：TangC,LeeAS,VolkmerJP,SahooD,NagD,MosleyAR,InlayMA,ArdehaliR,ChavezSL,PeraRR,BehrB,WuJC,WeissmanIL,DrukkerM.,NatBiotechnol.2011,29(9):829-34.非专利文献3：SulakO,CiociG,DeliaM,LahmannM,VarrotA,ImbertyA,WimmerovaM.,Structure.2010,18(1):59-72.非专利文献4：SuemoriH.,YasuchikaK.,HasegawaK.,FujiokaT.,TsuneyoshiN.,NakatsujiN.Biochem.Biophys.Res.Commun.2006,345,926-932.非专利文献5：DraperJS,PigottC,ThomsonJA,AndrewsPW.JAnat.2000,200,249-58.非专利文献6：Iijimaetal.Chem.Bio.Chem.2009,10,999-1006非专利文献7本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种判定干细胞的分化状态的方法，其特征在于，测定干细胞的培养上清液中下述(式1)或(式2)表示的未分化糖链标志物的是否存在或存在量：(式1)其中，R1表示OH基或任意的糖链，R2表示OH基或任意的糖链、蛋白质、脂质或其它分子，(式2)其中，R1表示OH基或任意的糖链，R2表示OH基或任意的糖链、蛋白质、脂质或其它分子。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.11.01 JP 2011-2399191.一种判定干细胞的分化状态的方法，其特征在于，测定干细胞的培养上清液中下述(式1)或(式2)表示的未分化糖链标志物的是否存在或存在量：(式1)其中，R1表示OH基或任意的糖链，R2表示OH基或任意的糖链、蛋白质或脂质，(式2)其中，R1表示OH基或任意的糖链，R2表示OH基或任意的糖链、蛋白质或脂质。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用由序列号1所示的氨基酸序列构成的蛋白质来测定所述未分化糖链标志物的有无或存在量。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述干细胞的培养上清液为对该干细胞施加了分化诱导处理后的培养上清液。4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，测...

【专利技术属性】
技术研发人员：馆野浩章，平林淳，伊藤弓弦，小沼泰子，浅岛诚，久野敦，藁科雅岐，福田雅和，
申请(专利权)人：独立行政法人产业技术综合研究所，和光纯药工业株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP