细胞因子产生细胞片及其利用方法技术

通过改变构成细胞片层叠体的细胞的种类、混合比例、接种的细胞数而改变细胞片层叠体内的细胞的状态，能够最优化促进血管新生的细胞因子的产生，另外也能够最优化血管内皮网络构建。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】通过改变构成细胞片层叠体的细胞的种类、混合比例、接种的细胞数而改变细胞片层叠体内的细胞的状态，能够最优化促进血管新生的细胞因子的产生，另外也能够最优化血管内皮网络构建。【专利说明】
本专利技术涉及在药物研发、药学、医学、生物等领域中有用的、产生与血管新生有关的细胞因子的细胞片、构建有高密度的血管内皮细胞网络的细胞片、其制造方法以及其利用方法。本申请是以2011年2月28日所提出的日本专利申请(日本特愿2011-043198号)为基础主张优先权的申请。
技术介绍
近年来，为了使受到损伤的生物体组织再生，各种各样的再生医疗技术备受瞩目。关于这些，以心肌组织的再生为例已经进行了多项研究，如:向心肌组织将心肌细胞、骨骼肌成肌细胞、间充质干细胞直接注入并再生的方法；如后所述，在特殊的温度响应性基材上培养心肌组织细胞，使温度变化，制成低损伤的心肌组织细胞片并移植进行再生的方法(参照专利文献I。)等，一部分细胞也开始转向人的临床研究。专利文献2中公开有:以心肌功能的改善、血管新生的促进、心肌组织的再生为目的，将选自心肌细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞以及骨骼肌成肌细胞的细胞作为移植片而进行利用的方法。另外，专利文献3中公开有:以心脏功能恢复为目的，将骨骼肌细胞组合物作为移植片而利用的方法。根据专利文献2和3，动物实验的例中，通过注入上述的移植片，确认有心功能的恢复，显示出其有效性。但是，专利文献2和3中公开的细胞移植片均为注入细胞悬浮液的方法，被移植的细胞具有如下问题:从移植部位流出且难以控制移植部位，另外，由于移植的细胞坏死而不能进行有效的移植等，期望更进一步的改善。作为解决上述问题的一种方法，开发出利用细胞片的移植法。预先，将成为移植片的细胞培养成片状，将它们移植入功能降低的生物体组织，从而现有的细胞悬浮液注入法中常见的、细胞向移植部位周边 的流出被抑制到最小限度，作为再生医疗的新技术而备受关注。移植所利用的多数细胞片，使用包括人细胞在内的动物细胞中特别是附着依赖性的细胞而制作。为了制成细胞片，需要将动物细胞在生物体外进行培养，将它们暂时附着于基材表面上。接着，将培养的细胞不散开地剥离、保持其在基材表面上培养的形态而使之剥离,这是必不可少的。作为细胞片的制作方法，专利文献I中公开有一种新型的细胞培养法，在被对水的上限或下限临界溶解温度为O~80°C的高分子覆盖基材表面的细胞培养支撑体上，在上限临界溶解温度(Upper critical solution temperature)以下或下限临界溶解温度(Lower critical solution temperature)以上培养细胞,其后设为上限临界溶解温度以上或下限临界溶解温度以下，由此不进行酶处理而使培养细胞剥离。另外，专利文献4中公开有，利用该温度响应性细胞培养基材在上限临界溶解温度以下或下限临界溶解温度以上培养皮肤细胞，其后设为上限临界溶解温度以上或下限临界溶解温度以下，由此使培养皮肤细胞以低损伤剥离。通过利用温度响应性细胞培养基材，能够谋求对于现有的培养技术进行各种各样的新型的拓展。进一步，专利文献5中发现，在用温度响应性聚合物覆盖基材表面而成的细胞培养支撑体上培养心肌组织的细胞，得到心肌样细胞片，其后，将培养液温度设为上限临界溶解温度以上或下限临界溶解温度以下，使培养的细胞片层叠体紧贴于聚合物膜，使之在该状态下与聚合物膜一起剥离，以及将其用规定的方法使之三维结构化，由此构建出结构缺陷少、在体外具备作为心肌样组织的几种功能的细胞片、以及三维结构。然而，此处的方法中，细胞片的层叠并非无限地进行，心肌样细胞片中以3层左右、厚度为100 μ m左右为界限，如果为其以上的厚度，则存在只有培养基、间质液扩散细胞才能存活的问题点。为了制作具有其以上的厚度的细胞片，制作伴随能够向三维化的组织中运送氧、营养的血管网的细胞片的技术的开发不可缺少，成为再生医疗领域的研究者等共同的课题。将大鼠心肌细胞片移植到大鼠心肌梗塞模型时，由于改善了由缺血而降低的心功能，因此确认了细胞片对于心肌的有效性(非专利文献I)。另外，通过作为能够临床应用的细胞的成肌细胞片、脂肪组织或来源于经血的间充质干细胞片，也确认有心功能改善；显示出来源于各种各样的细胞种的细胞片的有效性(非专利文献2、非专利文献3、非专利文献4)。将包含成肌细胞的细胞片移植至患病部位时，由细胞片稳定并持续地分泌血管内皮细胞增殖因子(VEGF)、肝细胞增殖因子(HGF)等各种细胞因子，它们促进血管新生，另外，由于基质细胞衍生因子(Stromal Cell-derived Factorl, SDF-1)等的分泌,干细胞被动员至细胞片移植部位周边，由此启示了心功能改善的可能性(旁分泌效果)。进一步，可以认为由细胞片分泌的细胞 因子，也作用于细胞片层叠体自身，对细胞片层叠体内部的血管网构建也带来影响(自分泌效果)。以此为背景，非专利文献5中公开有，作为得到具有100 μ m以上的厚度的细胞片层叠体的方法，在生物体内将细胞片层叠，在细胞片内新生出血管网时，进一步将细胞片层叠，通过重复该操作，得到Imm厚的心肌片层叠体。其中，启示出为了得到具有厚度的细胞片层叠体，需要对被层叠的细胞片内的各细胞供给营养、氧。为了用非专利文献5中公开的方法制作赋予了血管网的细胞片层叠体，有必需在生物体内重复层叠细胞片而从生物体侧衍生血管网的必要。每逢层叠细胞片都必须将移植部位开口，是一种向移植侧施加大的负担的方法。为了在生物体外制作具有超过100 μ m的厚度的细胞片层叠体，在生物体外赋予血管网的技术的开发是不可或缺的。公开有将大鼠心肌细胞和血管内皮细胞共培养时，能够得到在细胞片内形成有血管内皮细胞的网络结构的细胞片层叠体。将得到的细胞片层叠体移植于生物体内时，在移植部周边衍生出来源于细胞片的血管内皮细胞网络的毛细血管，更厚的心肌组织的再生变得可能(非专利文献6)。另外，通过构建血管内皮细胞网络，不仅能够制作具有厚度的细胞片层叠体，通过形成的血管网，各种细胞因子有效地分泌于移植部周边组织，由此也能够期待移植后的治疗效果的大幅提高。如上所述，本领域中，为了在生物体外制作模仿了生物体组织的组织，赋予血管网的技术是必不可缺的，要求进一步的改良。但是，到目前为止，尝试构建包含细胞片层叠体的三维生物体组织时，定量并且简便地评价三维生物体组织内所构建的血管内皮细胞网络的方法不存在。因此，对于最佳的构建有血管内皮网络的细胞片层叠体的设计方法尚无报道。因此，专利技术人等开发了将在细胞片层叠体内作为三维结构所构建的血管内皮细胞网络用二维的解析手法进行评价的技术(专利文献6)。通过利用该技术，变得可能将细胞片层叠体内的血管内皮细胞网络进行简单地评价。如果能够专利技术设计预先构建高密度的血管内皮网络的细胞片层叠体的方法，则可以认为不仅在生物体外也能够稳定地制作具有厚度的细胞片层叠体，促进血管新生且能够期待良好的治疗效果的细胞片层叠体也变得能够得到。现有技术文献专利文献专利文献1:日本特开平2-211865号公报专利文献2:日本特表2002-518006专利文献3:日本特表2003-505475专利文献4:日本特开平05-192138号公报专利本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：纪之冈正博，斋藤充弘，泽芳树，清水达也，冈野光夫，
申请(专利权)人：学校法人东京女子医科大学，国立大学法人大阪大学，
类型：
国别省市：