本发明专利技术涉及用于检测PIF存在与否的分析方法，以及通过此方法鉴定出来的PIF肽。具体地说，本发明专利技术涉及用于检测PIF的流式细胞术检测方法。它至少部分地基于如下观察结果：利用了荧光标记的抗淋巴细胞和抗血小板的抗体的流式细胞术表明，在PIF存在下，玫瑰花结的形成增加。它还基于如下观察结果：流式细胞术表明，在PIF存在下，与CD2结合的单克隆抗体减少了。本发明专利技术还涉及PIF肽，当PIF肽被加入到Jurkat细胞培养物中时，能够观察到它可以：或者(i)减少抗CD2抗体与Jurkat细胞的结合；或者(ii)增加Jurkat细胞中CD2的表达；或者(iii)减小Jurkat细胞的可存活性。在另外的实施方案中，本发明专利技术提供了ELISA检测方法，可以通过确定待测样品对抗CD2抗体与CD2底物相结合的效果而检测PIF。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植入前因子(preimplantation factor,以下简称为PIF),它是受孕和胚胎可存活性(embryo viability)的早期标志物。本专利技术还涉及检测PIF活性的新方法，以及PIF肽。2.
技术介绍
不育是困扰世界上数百万对夫妇的重要健康问题。人类孕体的早期死亡是一个常见现象，而这也是造成不育的一方面因素。在自然的单个胎儿(single conceptions)中，约有73%都在妊娠的第6周之前死亡(Boklage CE.，从受孕至足月生产之间人类胎儿的存活概率.国际生育学杂志(Int J Fertil) 1990; 35:75)。这主要是由于在植入之前或植入后的很短时间内所发生的早期胚胎死亡。大龄妇女的生育率较低，而由年轻妇女捐献卵母细胞后生育率提高，与上述现象相关的数据表明对于获得成功的妊娠而言，卵母细胞的质量很重要(Navot D, Bergh PA, Williams MA等,较差的卵母细胞质量而不是植入失败引起了与年龄相关的雌性生育力的下降，柳叶刀(Lancet) 1991; 337:1375)。体外受精(in vitro fertilization,以下简称为“IVF”)技术已经被发展起来，用于解决不育的问题。但是，在体外培养用于植入的胚胎时的人工条件下，维持胚胎的可存活性甚至更困难一些。在体外，胚胎的生长速度要比在体内时慢，通常只有25 — 65%的胚胎能够发育到囊胚阶段(在Gomel V, Leung PCK,编的“体外受精和辅助生殖”(Invitro fertilization and assisted reproduction)第 10届世界大会(Procc 10th WorldCongress)，1997:1 中的 Gardner DK, Lane M, KOuridakis K, Schoolvcraft WB.,基于生理学复合体的无血清培养基增强哺乳动物胚胎发育(Complex physiologically basedserum-free culture media increase mammalian embryo development))现有技术尚不倉泛鉴别出那些可能植入和存活的胚胎。人绒毛膜促性腺激素(hCG)是目前正在使用的用于体内受精和早期胚胎植入的标志物，但是，它只有在植入后的几天才能被检测到。由于缺乏胚胎可存活性的适当标志物，因此，目前很多不能植入的胚胎都被转移了，从而降低了获得成功妊娠的机会。为了解决胚胎可能无法存活的问题，更多数量的胚胎被同时转移到了未来母亲的体内。大量胚胎的转移可能导致多次怀孕(multiple pregnancies),这是固有的危险,但如果只转移少量胚胎，又可能有没有一个胚胎能植入的风险，从而失去一整个IVF周期。很明显，需要改进对胚胎的选择，并定义准确的标志物以确定胚胎的可存活性。此外，使用非侵入性方法，通过在培养基中检测对可存活的、能植入的胚胎特异的产物，将使得人们可以选择出那些最有可能产生成功妊娠的胚胎，而不会对胚胎产生伤害。决定妊娠成功与否的另一个因素是孕体与母体免疫系统之间的相互作用。在受精后的很短时间内，应该发生妊娠的系统母体识别(a systemic maternal recognition ofpregnancy)。由特异性早期胚胎信号所激发的母体免疫系统调节，可能是该过程中的关键。一旦卵母细胞被受精，合子直到孵化中的囊胚(hatching blastocyst)都被透明带(thezone pellucida)所包围，透明带是坚硬的半透明的膜。因此，当胚胎还在输卵管和子宫腔内发育时，胚胎一母体之间的交流(communication)就已经通过胚胎所分泌的化合物而同时发生了。 已经表明，以孕妇的血清和可存活胚胎为条件的培养基，可以提高血小板和T淋巴细胞在⑶2抗体存在下形成玫瑰花结的量。正如在1997年7月8日授权的Barnea等人的美国专利5，646，003以及1999年11月9日授权的Barnea等人的美国专利5,981, 198中已经公开的那样，植入前因子(PIF)的存在可以通过将淋巴细胞、血小板、来自怀孕受试者的热失活的血清、豚鼠补体以及Tll (抗⑶2)单克隆抗体(Dakko，丹麦)混合在一起而检测出来，其中，怀孕受试者的PIF提高了血小板和淋巴细胞之间形成的玫瑰花结的量。已经发现，PIF(i)由二细胞期前的可存活的早期人和小鼠胚胎所分泌；在IVF之后，在胚胎转移后的3 — 4天，可以在外周循环中检测到；(iii)与73%的带回家的婴儿有关，而在早期PIF阴性结果中则为3% ；(iv)在子宫内受孕后5 — 6天可以检测出来；(V)在未怀孕的血清或不可存活的胚胎中不存在；以及(vi)除了人之外，还存在于多种怀孕的哺乳动物中，包括小鼠、马、奶牛和猪。此外，如果发生自然流产，在hCG分泌减少前的两周，就已经观察到了 PIF从循环系统中的消失。在上述PIF检测中所使用的单克隆抗体，其靶标是被称为CD2的淋巴细胞相关抗原。⑶2存在于约80 — 90%的人外周血淋巴细胞上，以及超过95%的胸腺细胞、所有形成红细胞玫瑰花结的T淋巴细胞以及NK细胞的一个亚型上。⑶2在T细胞活化中的各种作用已经被提出，包括作为粘附分子以减小T细胞活化所需抗原的量，以及作为T细胞活化的共同刺激分子(costimulatory molecule)分子或直接促进剂。而且，已经暗示，0)2在诱导免疫无能、细胞因子生产的调节以及T细胞正选择的调控中起作用。⑶2的天然配基是结构相关的IgSF CAMs⑶58 (LFA-3)，一种组织分布较广的细胞表面粘附配基。此外，⑶2可以与⑶48、⑶59以及⑶15 (Lewis x)相关的糖结构发生相互作用。CD2以很低的亲和力与CD58结合，而解离常数却非常大。CD2及其配基CD58的侧向再分布也影响了细胞粘附的强度。CD2粘附性的调控影响了 CD2增强抗原敏感度的能力。不能进行亲和力调控的CD2细胞系在抗原特异性应答上表现出了明显的不足。CD2亲和力提高所产生的粘附力，直接为T细胞敏感度做出了贡献，而后者与CD2介导的信号转导无关。3.
技术实现思路
本专利技术涉及用于检测PIF存在与否的分析方法，以及通过此方法鉴定出来的PIF肽。具体地说，本专利技术涉及用于检测PIF的流式细胞术检测方法。它至少部分地基于如下观察结果利用了荧光标记的抗淋巴细胞和抗血小板的抗体的流式细胞术表明，在PIF存在下，玫瑰花结的形成增加。它还基于如下观察结果流式细胞术表明，在PIF存在下，与CD2结合的单克隆抗体减少了。本专利技术还涉及PIF肽，当PIF肽被加入到Jurkat细胞培养物中时，能够观察到它可以或者Q)减少抗CD2抗体与Jurkat细胞的结合；(ii)增加Jurkat细胞中CD2的表达；或者(iii)降低Jurkat细胞的可存活性。在另外的实施方案中，本专利技术提供了 ELISA检测方法，可以通过确定待测样品对抗CD2抗体与CD2底物相结合的效果而检测PIF。4.附图说明图1A-B.由小鼠胚胎培养物条件培养基(MECCM)的PIF纯化；(A)示出了MECCM-3kDA超滤液的高效液相色谱(HPLC)的谱图，所本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有序列Ser？Gln？Ala？Val？Gln？Glu？His？Ala？Ser？Thr的分离的肽。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：艾坦·巴尼，鲁宾·雷内·冈萨雷斯·佩雷斯，保罗·C·利维斯，
申请(专利权)人：倍奥英赛普特有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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