交配因子α原肽变体制造技术

本发明专利技术涉及可用于在酵母中重组表达包含GLP‑1肽的多肽的交配因子α原肽变体。本发明专利技术还涉及用于在酵母中表达多肽的DNA序列、载体和宿主细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及蛋白质表达和蛋白质化学的
，其中通过在酵母中重组表达而制备多肽。
技术介绍
重组多肽表达技术使得能够产生大量的由于例如其生物活性而可使用的所需多肽。这样的多肽通常在微生物宿主细胞中表达为重组融合多肽。感兴趣的多肽常常连接至融合伴侣多肽，以便提高表达水平、促进分泌、增加溶解度、促进多肽折叠，以保护该多肽免遭非故意的蛋白水解或促进感兴趣的多肽的纯化。为了确保从酵母中分泌重组表达的多肽，前原肽(pre-pro peptide)(通常被称为“前导序列”)通常融合至重组产物的N-末端。该前序列确保融合蛋白转位至内质网(ER)内，ER是分泌途径的起点。该原序列确保从ER进一步转运至高尔基体，在高尔基体中，被称为Kex2p的内源性蛋白酶通常用来切下该原序列。经处理的重组肽随后分泌至生长培养基，从该培养基中可以纯化该重组肽。当分泌重组多肽时，来自交配因子α(Mating Factor Alpha)的前原序列通常用作前导序列。然而，许多其他序列能够促进分泌过程。前导序列不仅对所分泌的肽的量，而且对有关降解和翻译后修饰如O-糖基化的质量具有重要影响。由于降解和O-糖基化通常是不希望的事件，因此期望一种将这些修饰减少至最低可能的程度，并且同时使分泌的多肽的产率最大化的前导序列。EP 0121884 A2描述了使用酵母α-因子在酿酒酵母(S.cerevisiae)中重组生产人胰岛素。EP 0324274A1描述了使用截短的α-因子前导序列改善异源蛋白质在酵母中的表达和分泌。Thim等人(PNAS 83(1986)6766-6770)描述了使用交配因子α在酿酒酵母中分泌和加工胰岛素前体。WO95/34666描述了用于在酿酒酵母中产生分泌的多肽的合成前导序列。Rakestraw等人(Biotech.Bioeng.103(2009)1192-1201)描述了突变的交配因子α前导序列，它增加单链抗体的分泌并且增加人IgG1在酿酒酵母中的产生水平。需要增加多肽前体的产率并减少O-糖基化的重组多肽的比例的更加特异性的前导序列。尤其需要用于在酵母中表达GLP-1肽的前导序列，该前导序列增加GLP-1肽或其前体的产率并减少GLP-1肽的O-糖基化。这样更加特异性的前导序列可以促进更高产率的重组多肽以及更低量的O-糖基化杂质。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供具有提高的异源多肽表达水平的酵母细胞。本专利技术的另一个目的是提供分泌重组多肽的酵母细胞，该重组多肽具有减少量的该重组多肽的O-糖基化变体。特别地，本专利技术的一个目的是提供具有提高的重组多肽表达水平和减少的O-糖基化变体量的酵母细胞。本专利技术的一个目的是提供用于在酵母细胞中重组表达GLP-1肽的改善的表达系统。根据本专利技术的第一方面，提供了一种用于在酵母中重组表达包含GLP-1肽的多肽的方法，其包括培养包含编码该多肽上游的加工和分泌信号的DNA序列的酵母菌株，其中所述加工和分泌信号包含在位置38-42处的VIGYL序列中具有至少一个置换从而包含通式(I)的氨基酸序列的交配因子α原肽变体：X38-X39-X40-X41-X42(SEQ ID NO:1) (I)其中X38是F、L、I或V；X39是L、I、V或M；X40是A、G、S、E、Q、Y、F、W、R、K、H、L、I、V或M；X41是S、Y、F、W、L、I、V或M；X42是Y、W、L、I、V、M或S；条件为X38-X42不是VIGYS。在用于在酵母中重组表达多肽的方法的一个实施方案中，所述交配因子α原肽变体在位置38-42处的VIGYL序列中具有至少一个置换，从而包含通式(I)的氨基酸序列：X38-X39-X40-X41-X42(I)其中X38是V；X39是L、I、V或M；X40是G或R；X41是Y，且X42是L。在另一个实施方案中，用于重组表达的多肽是GLP-1肽。在另一个实施方案中，用于重组表达的多肽包含GLP-1(7-37)[K34R]、GLP-1(9-37)[K34R]或GLP-1(9-37)[K34R,G37K]。根据本专利技术的第二方面，提供了一种交配因子α原肽变体，其在位置38-42处的VIGYL序列中具有至少一个置换，从而包含通式(I)的氨基酸序列：X38-X39-X40-X41-X42 (I)其中X38是F、L、I或V；X39是L、I、V或M；X40是A、G、S、E、Q、Y、F、W、R、K、H、L、I、V或M；X41是S、Y、F、W、L、I、V或M；X42是Y、W、L、I、V、M或S；条件为X38-X42不是VIGYS。根据本专利技术的第三方面，提供了一种GLP-1前体，它是一种融合多肽，其包含：-前肽(pre-peptide)，-交配因子α原肽变体，其在位置38-42处的VIGYL序列中具有至少一个置换，从而包含通式(I)的氨基酸序列：X38-X39-X40-X41-X42(SEQ ID NO:1) (I)其中X38是F、L、I或V；X39是L、I、V或M；X40是A、G、S、E、Q、Y、F、W、R、K、H、L、I、V或M；X41是S、Y、F、W、L、I、V或M；X42是Y、W、L、I、V、M或S；条件为X38-X42不是VIGYS，-任选的延伸肽，和-GLP-1多肽。根据本专利技术的第四方面，提供了编码所述交配因子α原肽变体或GLP-1前体的DNA序列。根据本专利技术的第五方面，提供了一种表达载体，其包含编码所述交配因子α原肽变体或GLP-1前体的DNA序列。根据本专利技术的第六方面，提供了包含根据本专利技术所述的表达载体的宿主细胞。在一个实施方案中，用于表达的宿主细胞具有非功能性pmt1基因或根本不具有pmt1基因。已惊人地发现，这样的宿主细胞除了由本专利技术的交配因子α原肽变体获得的O-糖基化多肽的量的降低外，还独立于所述降低而降低O-糖基化多肽的量。附图说明图1示出了如实施例1中使用的最小(minimal)表达质粒。图2示出了N-末端延伸的GLP-1(7-37)[K34R]前体，其包括野生型交配因子α前原肽，指示出了原肽的VIGYL亚序列。具体实施方式根据本专利技术的第一方面，提供了一种用于在酵母中重组表达多肽的方法，其包括培养包含编码该多肽上游的加工和分泌信号的DNA序列的酵母菌株，其中所述加工和分泌信号包含在位置38-42处的VIGYL序列中具有至少一个置换从而包含通式(I)的氨基酸序列的交配因子α原肽变体：X38-X39-X40-X41-X42(SEQ ID NO:1) (I)其中X38是F、L、I或V；X39是L、I、V或M；X40是A、G、S、E、Q、Y、F、W、R、K、H、L、I、V或M；X41是S、Y、F、W、L、I、V或M；X42是Y、W、L、I、V、M或S；条件为X38-X42不是VIGYS。如本文所用的术语“前导序列”意在表示由前肽(信号肽)和原肽组成的氨基酸序列。前导序列的非限制性实例是例如来自酿酒酵母的α-因子信号前导序列和WO95/34666中所述的用于酵母的合成前导序列。如本文所用的“前肽”意在表示作为N-末端序列存在于待表达的多肽的前体形式上的信号肽。信号肽的功能是在宿主细胞中促进多肽转位至内质网内。信号肽通常在该过程期间被切下。信号肽可以与产生该多肽的宿主细胞是异源或同本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于在酵母中重组表达包含GLP‑1肽的多肽的方法，其包括培养包含编码该多肽上游的加工和分泌信号的DNA序列的酵母菌株，其中所述加工和分泌信号包含在位置38‑42处的VIGYL序列中具有至少一个置换从而包含通式(I)的氨基酸序列的交配因子α原肽变体：X38‑X39‑X40‑X41‑X42(SEQ ID NO:1)      (I)其中X38是F、L、I或V；X39是L、I、V或M；X40是A、G、S、E、Q、Y、F、W、R、K、H、L、I、V或M；X41是S、Y、F、W、L、I、V或M；X42是Y、W、L、I、V、M或S；条件为X38‑X42不是VIGYS。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.02.28 EP 14157172.91.一种用于在酵母中重组表达包含GLP-1肽的多肽的方法，其包括培养包含编码该多肽上游的加工和分泌信号的DNA序列的酵母菌株，其中所述加工和分泌信号包含在位置38-42处的VIGYL序列中具有至少一个置换从而包含通式(I)的氨基酸序列的交配因子α原肽变体：X38-X39-X40-X41-X42(SEQ ID NO:1) (I)其中X38是F、L、I或V；X39是L、I、V或M；X40是A、G、S、E、Q、Y、F、W、R、K、H、L、I、V或M；X41是S、Y、F、W、L、I、V或M；X42是Y、W、L、I、V、M或S；条件为X38-X42不是VIGYS。2.根据权利要求1所述的方法，其中X38是F、L或V；X39是L、I、V或M；X40是G或R；X41是S、Y、L、I、V或M，并且X42是Y、W、L、V或M。3.根据权利要求1所述的方法，其中X38是I或V；X39是L、I、V或M；X40是A、G、S、E、Q、Y、F、W、R、K、H、L、I、V或M；X41是Y、F或W，并且X42是L或I。4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中X38是V；X39是L、I、V或M；X40是G或R；X41是Y，并且X42是L。5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中X40是R。6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其中与SEQ ID NO:2所示的交配因子α原肽(氨基酸残基20-85)相比，所述交配因子α原肽变体在X38-X42序列之外具有少于10个氨基酸残基变化。7.根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其中所述酵母携带至少一个降低其O-糖基化能力的遗传修饰。8.根据权利要求7所述的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：P诺加亚尔德，
申请(专利权)人：诺和诺德股份有限公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK