本发明专利技术涉及分子生物学领域，具体的说是半滑舌鳎B细胞激活因子的免疫应用。半滑舌鳎B细胞激活因子作为疫苗增强因子的应用。本发明专利技术的BAFF表达质粒能显著增强DNA疫苗的免疫保护效应。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学领域，具体的说是半滑舌鳎B细胞激活因子的免疫应用。
技术介绍
B细胞活化因子（B cell activating factor，BAFF)，属于肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF)家族，是一个典型的II型跨膜蛋白，分子量约为31kDa，由胞质区、 跨膜区和胞外功能区组成。在哺乳动物中BAFF在体液免疫中发挥着重要作用，其能结合并 刺激B淋巴细胞，并分泌免疫球蛋白，且它对T细胞的功能亦有一定的调节作用。BAFF与其 三个受体BAFF-R、TACI和BCMA结合后可激活NF- κ B、mTOR、p38、JNK等信号通路，维持免 疫细胞生存、分化和成熟，并且具有抗凋亡的作用。BAFF对B细胞的发育过程具有关键的 调节作用，在BAFF基因完全缺失的小鼠中，B淋巴细胞的发育和抗体的产生受到严重影响。 因此，BAFF为一种与机体免疫调控密切相关的细胞因子。目前鱼类BAFF研宄很少，其功能 几乎完全未知。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种鱼类B细胞激活因子的免疫应用。 为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为： -种鱼类B细胞激活因子的免疫应用，半滑舌鳎B细胞激活因子作为疫苗增强因 子的应用。 进一步的说，半滑舌鳎B细胞激活因子作为DNA疫苗增强因子的应用。 所述半滑舌鳎B细胞激活因子（BAFF)的表达质粒的稀释液与DNA疫苗质粒的稀 释液按体积比为1:1比例混合。 所述半滑舌鳎B细胞激活因子（BAFF)的表达质粒与DNA疫苗质粒采用PBS缓冲 液稀释至400ug/ml。 所述BAFF表达质粒是以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物Fl和Rl进行PCR扩增， PCR产物与载体pBS-T连接，获得质粒pBSBAFF ;用限制性内切酶EcoRV酶切pBSBAFF后回 收0. 5kb片段，与质粒pCN3连接，得BAFF表达质粒pBAFF ; 所述 Fl 为 5? -GATATCGCCACCATGACTATTGTGTCTCAGT-3? ；R1 为 5' -GATATCAACCAGTTTGAAAGCG-3'。 本专利技术具有如下优点：本专利技术的半滑舌鳎B细胞激活因子BAFF能够显著提高DNA 疫苗的免疫保护效应。【附图说明】 图1为本专利技术实施例提供的BAFF增强疫苗诱导的血清抗体水平图。【具体实施方式】 下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。实施例旨在对本专利技术进行举例描述，而 非以任何形式对本专利技术进行限制。 在本专利技术实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法： 1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用"天根生化科技 (北京）有限公司"的相应试剂盒。 2.大肠杆菌用 Hanahan 方法（Sambrook and Russell:Molecular Cloning: A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor Laboratory Press2001)〇 3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于"纽英伦生物技术有限公司"，北京。 实施例1 BAFF的表达质粒pBAFF的构建： 本专利技术的 BAFF 的序列已公开（GenBank accession No. XM_008328682)。BAFF 由 261个氨基酸组成，有一个保守的TNF(tissue necrosis factor)结构域。以半滑舌鳎 cDNA为模板，用引物Fl和Rl进行PCR扩增。PCR条件为：94°C 60s预变性模板DNA，然后 94°〇4〇8,51°〇6〇8,72°〇6〇8,5个循环后改为94°〇4〇8,58°〇6〇8,72°〇6〇8,30个循环。 PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化后与PCR克隆载体pBS-T (购自于"天根生化科 技有限公司"，北京）于室温连接2 - 4小时，连接混合液转化到大肠杆菌DH5 α后在含有 100 μ g/ml安卡青霉素（Ap)、40 μ g/ml 5-溴-4-氯-3-吲噪-β-D-乳糖苷（x-gal)和 24 μ g/ml异丙基-β -D-硫代半乳糖苷（IPTG)的LB固体培养基上培养18 - 24小时，挑出 白色转化子，提取质粒，命名为质粒pBSBAFF。将质粒pCN3 (构建过程参见Jiao XD，Zhang M, Hu YH, Sun L Construction and evaluation of DNA vaccines encoding Edwardsiella tarda antigens. Vaccine 2009;27:5195 - 202.)用 EcoRV 酶切，回收 5. 4kb 片段，同时将 pBSBAFF用EcoRV酶切回收0. 5kb片段。将上述回收的两片段用T4DNA连接酶于室温连接 2 - 4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5 α，在含卡那霉素（50ug/ml)的LB培养基上培养 18 - 24小时，筛选转化子提取质粒，命名为pBAFF。通过DNA测序分析证明了 pBAFF为含 有TNF结构域的BAFF序列的表达质粒，其中pBAFF质粒中的BAFF序列与GenBank access ion公开的No. XM_008328682中记载的一致。 所述LB组成成分按重量百分比计：1. 0 %蛋白胨，0. 5 %酵母粉，1. 0 %氯化 钠，97. 5 % 蒸馏水。所述 Fl 为 5' -GATATCGCCACCATGACTATTGTGTCTCAGT-3' ；R1 为 5' -GATATCAACCAGTTTGAAAGCG-3'。 实施例2 BAFF表达质粒pBAFF的免疫应用 步骤1)免疫半滑舌鳎 将迟缓爱德华氏菌DNA疫苗质粒pCEsal(其构建过程见Sun Y，Liu C，Sun L. Construction and analysis of the immune effect of an Edwardsiella tarda DNA vaccine encoding a D15_like surface antigen. Fish Shellfish Tmmunol. 2011 ； 30:273 - 9.)和上述实施例1的pBAFF分别在PBS中稀释至400ug/ml，将二者等体积混合， 即为pCEsal+pBAFF混合液。将pCEsal和pBAFF分别在PBS中稀释至200ug/ml，即为pCEsal 稀释液和pBAFF稀释液。将140条半滑舌鳎（重约14. 5g)随机分为4组，每组35条。将 这4组分别命名为A、B、C和D。将A组的每条鱼肌肉注射0.1 ml pCEsal稀释液，将B组的 每条鱼肌肉注射0.1 ml pBAFF稀释液，将C组的每条鱼肌肉注射0.1 ml pCEsal+pBAFF混合 液，将D组（对照组）的每条鱼肌肉注射0· Iml PBS。 所述PBS组成成分按重量百分比计：0. 8 % NaCl, 0. 02 % KC1, 0. 358 % Na2HPO4. 12H20, 0· 024% NaH2PO4,余量为水。 步骤2)细菌悬液制备 将迟缓爱德华氏菌TXl在LB培养基中培养至0D_为0.8,然后离心（5000g， 4°C ) lOm本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鱼类B细胞激活因子的免疫应用，其特征在于：半滑舌鳎B细胞激活因子作为疫苗增强因子的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孙黎，孙云，迟恒，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37
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