检测活运动神经元蛋白质的表达的方法技术

本发明专利技术涉及一种检测SMN蛋白质的表达的方法，其包含：对含有源自血液的有核细胞的样品中的SMN蛋白质进行标识的工序；对所述样品中的所述有核细胞的核进行标识的工序；对所述有核细胞中的核及SMN蛋白质被标识了的细胞群进行分选的工序；以及对所述分选出的细胞群，基于对SMN蛋白质的标识对SMN蛋白质的表达进行检测的工序。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种检测活运动神经元(SMN)蛋白质的表达的方法。
技术介绍
脊髓性肌肉萎缩症(SMA)为由于脊髓前角细胞的病变而引起的肌肉萎缩症，显示以躯干或四肢的肌肉力量降低及肌肉萎缩为特征的下运动神经元症状。SMA根据发病年龄和重症程度分为I型～IV型，至出生后6个月发病的I型：重症型(也称为韦霍麻痹)、至1岁6个月发病的II型：中间型(也称为Dubowitz病)、及在1岁6个月以后发病的III型：轻症型(也称为Kugelberg-Welander病)为幼儿期发病SMA。另一方面，在20岁以后发病的IV型为成人发病SMA。I型SMA占SMA的约30％，在6个月以下发病。其症状极其深刻，不能保持生活坐姿，极少不用人工呼吸而可以生存2岁以上的情况。II型SMA不能进行生活起立及行走，III型SMA虽然获得自行直立行走，但是，容易转移至下一阶段，出现不能行走或不能站立的症状。但是，SMA的根本治疗法依然未能确立，SMA为国家指定的难治之症中的一个。许多幼儿期发病SMA的原因基因为存在于第5号染色体长臂5q13的SMN1基因。在许多幼儿期发病SMA中，可确认到SMN1基因的缺失或变异，幼儿期发病SMA作为常染色体隐形遗传性疾病被识别。由SMN1基因表达SMN蛋白质，认为SMN蛋白质参与运动神经元的形成等。另外，在SMN1基因存在的第5号染色体的相同区域中，存在有SMN2基因，其编码区域的碱基仅1个与SMN1基因不同。在幼儿期发病SMA患者中，SMN1基因缺失或变异，源自SMN1基因的SMN蛋白质降低，另一方面，SMN2基因正常地起作用。因此，在幼儿期发病SMA患者中，源自SMN2基因的SMN蛋白质也进行表达，根据源自该SMN2基因的SMN蛋白质的表达量，认为症状的重症度不同。但是，SMN1基因的转录产物为全长SMNmRNA，与此相对，将由SMN1基因所转录的全长SMNmRNA的量设为100％时，SMN2基因的转录产物大约为全长SMNmRNA的10％，确认了外显子7缺失的短缩型SMNmRNA为大约90％。短缩型SMNmRNA翻译成非功能性的蛋白质，仅全长SMNmRNA正常地翻译成SMN蛋白质，因此，在SMN1基因缺失或变异的幼儿期发病SMA患者中，SMN蛋白质的表达量与正常人相比低，仅正常人的10％～20％左右。因此，由于SMN1基因缺失或变异，产生肌肉力量降低及肌肉萎缩。在SMN1基因缺失的幼儿期发病SMA患者中，SMN2基因有时替换SMN1基因而存在。该情况下，SMN2基因在1个染色体上存在2个拷贝，源自SMN2基因的SMN蛋白质的表达量也根据拷贝数而变多。得知：在幼儿期发病SMA患者中，源自SMN2基因的SMN蛋白质的表达量越增加，症状越变轻。如上所述，SMN蛋白质的表达量与幼儿期发病SMA密切地关联，SMN蛋白质认为有可能成为用于幼儿期发病SMA的诊断、或用于可靠地判断药剂的效果的有用的生物标记。但是，在幼儿期发病SMA患者中，对SMN蛋白质的表达自身进行确认，为了将SMN蛋白质作为幼儿期发病SMA的有用的生物标记利用，需要在将正常人和患者进行比较时能够检测出SMN蛋白质表达水平的差异的程度的敏锐度。另外，幼儿期发病SMA为常染色体隐形遗传性疾病，在1对常染色体中的一条染色体中仅SMN1基因缺失或变异的情况下，没有出现任何肌肉力量降低及肌肉萎缩的症状，称为携带者。在携带者中，虽然与患者相比SMN蛋白质的表达量高，但是，认为在携带者和患者之间，不存在如正常人和患者之间的SMN蛋白质的表达量之差那么大的差异。因此，为了将SMN蛋白质作为幼儿期发病SMA的有用的生物标记利用，需要在将携带者和患者进行比较时能够检测出SMN蛋白质表达水平的差异的程度的更进一步的敏锐度。实际上尝试了使用有末梢血单核球细胞的、利用ELISA法的SMN蛋白质的定量分析(Dione T.Kobayashi et al.,Plos one,November 2012,Vol.7,Issue11,e50763,Evaluation of Peripheral Blood Mononuclear Cell Processing and Analysis for Survival Motor Neuron Protein)。但是，Kobayashi等报道有如下结果：在幼儿期发病SMA患者和携带者之间，用ELISA法不能确认到SMN蛋白质表达水平上的显著差异。并且，Kobayashi等甚至公开了SMN蛋白质表达水平在SMA的诊断中不能成为具有可靠性的指标。另外，在利用ELISA法的SMN蛋白质的定量分析中，必须使用末梢血单核球细胞(PBMC)，对从患者等得到的血液样品进行离心分离等需要花费时间，并且细胞的收率也降低。因此，利用使用PBMC的ELISA法的SMN蛋白质的定量中，所需要的采血量也增大。如上所述，在现有技术中，为了将SMN蛋白质作为幼儿期发病SMA的有用的生物标记而利用，存在各种各样的问题，对SMA的根本治疗法的确立成为很大的障碍。另外，使用全血(末梢血)或使全血中的红细胞溶血而得到的物质等血液样品，至今没有报道能够检测出对正常人和幼儿期发病SMA患者进行比较后的SMN蛋白质表达水平的差异的，且具有可靠性的SMN蛋白质的检测方法。
技术实现思路
目前，在幼儿期发病SMA患者和正常人之间、和/或在幼儿期发病SMA患者和携带者之间，能检测出SMN蛋白质表达水平的差异的，且使用了血液细胞样品的具有可靠性的SMN蛋白质表达的检测方法尚未被发现。本专利技术的目的在于，提供一种在幼儿期发病SMA患者和正常人之间、和/或在幼儿期发病SMA患者和携带者之间，能够检测出SMN蛋白质表达水平的差异的，且使用了血液细胞样品的具有可靠性的检测SMN蛋白质的表达的方法。本专利技术人等重复进行了深入研究的结果重新发现：关于检测SMN蛋白质的表达的细胞，从血液细胞中分选特定的细胞群，对在该细胞群中SMN蛋白质的表达进行检测，由此提高SMN蛋白质表达水平的检测灵敏度。在本专利技术的一个实施方式中，是对SMN蛋白质的表达进行检测的方法，所述方法包括：对含有源自血液的有核细胞的样品中的SMN蛋白质进行标识的工序；对所述样品中的所述有核细胞的核进行标识的工序；对所述有核细胞中的核及SMN蛋白质被标识了的细胞群进行分选的工序；以及对所述分选出的细胞群，基于对SMN蛋白质的标识检测SMN蛋白质的表达的工序。本专利技术的一个实施方式中，在SMN蛋白质表达的检测方法中，对含有源自血液的有核细胞的样品中的SMN蛋白质进行标识的工序包含利用第1荧光色素标识SMN蛋白质，且对SMN蛋白质的表达进行检测的工序包含对所述第1荧光色素发出的荧光强度进行测定。本专利技术的一个实施方式中，在SMN蛋白质表达的检测方法中，对含有源自血液的有核细胞的样品中的SMN蛋白质进行标识的工序包含利用第1荧光色素标识SMN蛋白质，且标识含有源自血液的有核细胞的样品中的有核细胞的核的工序包含利用第2荧光色素标识核。本专利技术的一个实施方式中，在SMN蛋白质表达的检测方法中，对有核细胞中的核及SMN蛋白质被标识了的细胞群进行分选的工序包含：在同一装置内，对第1荧光色素发出的第1荧光强度和第2荧光色素发出的第2荧光强度进行测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测方法，其是对SMN蛋白质的表达进行检测的方法，该方法包括：对含有源自血液的有核细胞的样品中的SMN蛋白质进行标识的工序；对所述样品中的所述有核细胞的核进行标识的工序；对所述有核细胞中的核及SMN蛋白质被标识了的细胞群进行分选的工序；以及对所述分选出的细胞群，基于对SMN蛋白质的标识检测SMN蛋白质的表达的工序。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.04.03 JP 2014-0769851.一种检测方法，其是对SMN蛋白质的表达进行检测的方法，该方法包括：对含有源自血液的有核细胞的样品中的SMN蛋白质进行标识的工序；对所述样品中的所述有核细胞的核进行标识的工序；对所述有核细胞中的核及SMN蛋白质被标识了的细胞群进行分选的工序；以及对所述分选出的细胞群，基于对SMN蛋白质的标识检测SMN蛋白质的表达的工序。2.如权利要求1所述的方法，其中，所述标识SMN蛋白质的工序包含利用第1荧光色素对SMN蛋白质进行标识，且所述检测SMN蛋白质的表达的工序包含对所述第1荧光色素发出的荧光强度进行测定。3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述标识SMN蛋白质的工序包含利用第1荧光色素标识SMN蛋白质，且所述标识核的工序包含利用第2荧光色素标识核。4.如权利要求3所述的方法，其中，所述分选细胞群的工序包含：在同一装置内对所述第1荧光色素发出的第1荧光强度和所述第2荧光色素发出的第2荧光强度进行测定，以及将测定得到的第1荧光强度及第2荧光强度表示于二维坐标上。5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述分选细胞群的工序及所述检测SMN蛋白质的表达的工序利用成像流式细胞仪进行。6.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，所述含有源自血液的有核细胞的样品包含如下得到的有核细胞：使血液中的红细胞溶血，接着通过离心分离而使有核细胞沉淀。7.一种检测方法，其是对SMN蛋白质进行检测的方法，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：斋藤加代子，荒川玲子，荒川正行，野本明男，
申请(专利权)人：学校法人东京女子医科大学，公益财团法人微生物化学研究会，
类型：发明
国别省市：日本;JP