本发明专利技术公开一种定量检测cTnI的荧光免疫层析试剂及其制备方法，属于临床医学诊断领域。该试剂由试纸条和荧光液两部分组成。其中，试纸条包括底板、Fusion5、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述Fusion5、硝酸纤维素膜和吸水垫水平方向顺序连接固定于底板上。所述硝酸纤维素膜上包被有cTnI单克隆抗体1的检测线和兔IgG抗体构成的质控线。荧光液包含cTnI单克隆抗体2标记的荧光微球、羊抗兔抗体标记的荧光微球。本发明专利技术利用时间分辨荧光微球提高荧光强度，降低背景信号，同时定量检测全血、血清或血浆中的cTnI含量,样本仅需要10～20微升。该试纸条具有方便快捷、操作简单、检测时间短、特异性强、灵敏度高、检测结果更加准确，适用于临床POCT的快速诊断。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于临床医学诊断领域，具体涉及一种定量检测cTnI的荧光免疫层析试剂及制备方法。
技术介绍
心肌肌钙蛋白(cardiac troponin，cTn)是心肌肌肉收缩的调节蛋白。cTn是由三种不同基因的亚基组成：心肌肌钙蛋白T(cTnT)、心肌肌钙蛋白I(cTn I)和肌钙蛋白C(TnC)1.2。目前，用于ACS实验室诊断的是cTnT和cTnI。TnI(肌钙蛋白I)存在三种亚型：骨骼肌肌钙蛋白I(sTnI)中存在快骨骼肌型和慢骨骼肌型，它们具有相似的分子量(20KD)，但二者之间的氨基酸序列约存在40％的差异；第三种为心肌型。心肌肌钙蛋白I(cTnI)与骨骼肌型的氨基酸序列也存在40％的差异。但人的cTnI氨基末端比sTnI多31个氨基酸，使其分子量达到22KD，这种独特的顺序使之具有较高的心肌特异性，有助于制备相应的单克隆。cTn是以cTnI-C-T复合物和游离cTnI形式存在于心肌细胞中，心肌损伤时释放到血循环中后，cTnI-C-T可进一步分解为cTnI-C复合物和游离cTnI。故血循环中除cTnI-C-T、游离cTnI外还有cTnI-C，而且cTnI-C是其在血液中的主要形式。其代谢产物由肾脏排出体外。测定心肌功能障碍标志物被作为诊断急性心肌梗塞(AMI：acute myocardial infarction)的标准手法，特别是心电图未发现异常时，可作为对有助于诊断的手法。据报告，cTnI浓度的上升，对诊断AMI、心脏挫伤、不稳定型心绞痛病人的心肌特异性障碍非常有用。AMI时，cTnI会在4-8小时内从损伤的心肌细胞释放到血液中，并超出正常浓度范围。通常，AMI发病12-18小时后，达到最高浓度，在5-10天内维持高值3.4。对于AMI病人，cTnI浓度随着时间变化的增减，类似于CKMBmass(总肌酸激酶MB异构体量)。发病初期的浓度上升，虽然比CK-MB迟，但在美国心脏病学会和美国心脏协会的最新指南5.6显示，由于对心肌的高特异性和诊断效率等原因，cTnI对检测心肌功能障碍，具有较高的应用价值。cTnI作为一种新的诊断标志物被应用于AMI的临床诊断，特别是对那些没有心电图诊断的患者更加重要7.8。中国专利申请号201510070592.9披露了一种肌钙蛋白I超敏检测试剂盒及超敏检测方法，该申请号专利利用磁性微球标记不同目标物的抗体，实现肌钙蛋白I超敏检测。该申请号专利需要100μL的样本测试，而且最高只能到50ng/ml，特别是对于样本量少的和严重的心梗患者，该专利的测试还不能达到要求。中国专利申请号201110440258.X公布了一种胶乳增强免疫比浊法测试心肌钙蛋白T的超敏感方法。该申请号专利采用聚苯乙烯胶乳颗粒作为标记物，该方法需要大量的抗体原料，大大提高了抗体的用量和试剂的成本。此外，该方法还是需要25μL的样本测试，而且最高仅仅能达到10ng/ml。中国专利申请号201420648352.3披露了一种利用量子点标记测试肌钙蛋白I超敏检测试剂盒，该申请号专利利用量子点标记不同目标物的抗体，实现肌钙蛋白I超敏检测。该申请号专最高也只能到20ng/ml，特别是对严重的心梗患者，该专利的测试还不能达到要求。现有的cTnI检测方法主要有酶联免疫法(ELISA)，化学发光法和酶联荧光分析法。ELISA方法测定周期长；化学发光法和酶联荧光分析法价格昂贵，需有专门仪器和专业人员操作，只适用于中心实验室使用，检测结果到达医生手中的时间较长，不能满足临床快速检测需要，也不适合于中小医院尤其是没有中心实验室的乡镇医院。胶乳增强免疫比浊法操作简单，但一般可以采用物理吸附法和化学偶联法，物理吸附法稳定性较化学偶联法要差，易受到类风湿性因子(RF)和嗜异性抗体的干扰，导致检测结果假阳性或假性升高。两种偶联方法将导致抗体结合力的损失，增加了抗体用量和生产成本。胶体金免疫层析法标本用量少，简便快速，适合于cTnI的床旁检测。但胶体金免疫层析法仅能进行定性测定，对于定量测定则灵敏度很差。基于胶体金免疫层析法开发的检测卡，虽然可快速完成cTnI定性检测，但同样由于灵敏度较低的问题，在AMI早期，血清中仅含有少量cTnI的情况下，胶体金免疫层析法无法准确诊断出AMI的发作，所以在临床应用上还是有很大的局限性。现在的有些试剂的检测范围太窄，不能达到临床检验的目的。CN201510012347.2需要10μL的样本，但需要有样本的稀释过程，操作繁琐。而现在的有很多的测试方法CN201410561126.6需要100μL的全血样本。因为全血样本中含有很多的干扰物质，随着检测样本全血量的增加，干扰因素也会逐渐提高。所以在检测全血样本时，降低全血样本所需要的量变的越来越重要。
技术实现思路
本专利技术的目的是提一种定量检测cTnI的荧光免疫层析试剂，该试剂能在较短的检测时间内完成cTnI的检测，检测时间短，检测灵敏度高。本专利技术还提供了定量检测cTnI的荧光免疫层析试剂的制备方法。一种定量检测cTnI的荧光免疫层析试剂由试纸条和荧光液两部分组成。所述的试纸条包括底板(1)、Fusion5(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水垫(4)。所述Fusion5(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水垫(4)水平方向顺序连接固定于底板上。所述硝酸纤维素膜(3)上包被有cTnI单克隆抗体1(5)、的检测线和兔IgG抗体(6)构成的质控线。所述的荧光液(7)包含cTnI单克隆抗体2标记的时间分辨荧光微球、羊抗兔抗体标记的时间分辨荧光微球。所述的时间分辨荧光微球选自修饰过的聚苯乙烯微球。所述的聚苯乙烯微球，表面修饰官能团为羧基、羟基或环氧基的一种，粒径为100～500nm。所述cTnI单克隆抗体1选自9701 85～95单克隆抗体、MF4 190～196单克隆抗体中的一种；所述cTnI单克隆抗体2选自M18 18～28单克隆抗体、19C7 41～49单克隆抗体中的一种。所述的时间分辨荧光微球内部填充镧系元素的螯合物。所述的镧系元素为铕、钐、鈊、镝中的一种。优选的，所述镧系元素为铕。所述的荧光液的配制方法如下：(1)cTnI单克隆抗体2标记时间分辨荧光微球的制备及稀释：将时间分辨荧光微球溶于100mmol/L MES缓冲液中，每1mg时间分辨荧光微球对应100-300μL MES缓冲液,加入活化剂NHS和EDC,EDC的终浓度为0.05％-0.1％，NHS的终浓度为0.1％-0.2％；随后加入氨基己酸，使得微球表面连接手臂,每1mg时间分辨荧光微球对应10-100μL 50mmol/L氨基乙酸；洗涤、20000-25000rpm离心后，再次加入活化剂活化，EDC的终浓度为0.05％-0.1％，NHS的终浓度为0.1％-0.2％；再次洗涤、20000-25000rpm离心，将时间分辨荧光微球用硼酸缓冲液复溶，随后加入cTnI单克隆抗体2进行反应1h，微球与抗体的质量比为10mg:0.01mg～2.0mg；反应完后加入封闭剂进行封闭，封闭剂的终浓度为2-3％；封闭2h，洗涤、20000-25000rpm离心，再次用pH为7-9的60-100mmol/L硼酸缓冲液及封闭剂复溶、超声，封闭剂的终浓度为2-3％，cTnI抗体标记时间分辨荧光微球终浓度本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种定量检测cTnI的荧光免疫层析试剂，其特征在于：该试剂由试纸条和荧光液两部分组成；所述的试纸条包括底板(1)、Fusion5(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水垫(4)；所述Fusion5(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水垫(4)水平方向顺序连接固定于底板上；所述硝酸纤维素膜(3)上包被有cTnI单克隆抗体1(5)的检测线和兔IgG抗体(6)构成的质控线；所述的荧光液(7)包含cTnI单克隆抗体2标记的的时间分辨荧光微球、羊抗兔抗体标记的时间分辨荧光微球。
【技术特征摘要】
1.一种定量检测cTnI的荧光免疫层析试剂，其特征在于：该试剂由试纸条和荧光液两部分组成；所述的试纸条包括底板(1)、Fusion5(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水垫(4)；所述Fusion5(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水垫(4)水平方向顺序连接固定于底板上；所述硝酸纤维素膜(3)上包被有cTnI单克隆抗体1(5)的检测线和兔IgG抗体(6)构成的质控线；所述的荧光液(7)包含cTnI单克隆抗体2标记的的时间分辨荧光微球、羊抗兔抗体标记的时间分辨荧光微球。2.根据权利要求1所述的定量检测cTnI的荧光免疫层析试剂，其特征在于：所述的时间分辨荧光微球选自修饰过的聚苯乙烯微球。3.根据权利要求2所述的定量检测cTnI的荧光免疫层析试剂，其特征在于：所述的聚苯乙烯微球，表面修饰官能团为羧基、羟基或环氧基的一种，粒径为100～500nm。4.根据权利要求1所述的定量检测cTnI的荧光免疫层析试剂，其特征在于：所述cTnI单克隆抗体1选自9701 85～95单克隆抗体、MF4 190～196单克隆抗体中的一种；所述cTnI单克隆抗体2选自M18 18～28单克隆抗体、19C7 41～49单克隆抗体中的一种。5.根据权利要求1所述的定量检测cTnI的荧光免疫层析试剂，其特征在于：所述的时间分辨荧光微球内部填充镧系元素的螯合物。6.根据权利要求5所述的定量检测cTnI的荧光免疫层析试剂，其特征在于：所述的镧系元素为铕、钐、鈊、镝中的一种。7.根据权利要求1所述的定量检测cTnI的荧光免疫层析试剂，其特征在于，所述的荧光液的制备步骤如下：(1)cTnI单克隆抗体2标记时间分辨荧光微球的制备及稀释：将时间分辨荧光微球溶于100mmol/L MES缓冲液中，每1mg时间分辨荧光微球对应100-300μL MES缓冲液,加入活化剂NHS和EDC,EDC的终浓度为0.05％-0.1％，NHS的终浓度为0.1％-0.2％；随后加入氨基乙酸，使得微球表面连接手臂,每1mg时间分辨荧光微球对应10-100μL 50mmol/L氨基乙酸；洗涤、20000-25000rpm离心后，再次加入活化剂活化，EDC的终浓度...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱奇朗，石晓强，朱传增，张蕾，张珂，李福刚，徐建新，
申请(专利权)人：上海奥普生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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