重组毒素蛋白的高水平表达制造技术

本发明专利技术涉及在细菌宿主中生产重组毒素蛋白的领域。本发明专利技术尤其涉及从细菌宿主中获得高水平重组CRM?197、白喉毒素、百日咳毒素、破伤风类毒素C片段、霍乱毒素B、霍乱全毒素和假单胞菌外毒素A的生产方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】重组毒素蛋白的高水平表达优先权要求本申请根据35 U. S. C. $119(e)要求2010年4月16日提交的美国临时申请系列号61/325，235,2010年4月9日提交的PCT/US 10/30573和2010年3月30日提交的美国临时申请系列号61/319，152的优先权。这些申请的内容特此通过引用整体并入本文。序列表本申请包含通过EFS-Web以ASCII格式提交的序列表，该序列表特此通过引用整体并入本文。创建于2011年3月16日的所述ASCII拷贝被命名为38194201. txt，其大小为156，975个字节。专利技术背景 微生物毒素蛋白在医学中用作针对产生毒素的微生物的疫苗接种的免疫原以及用作其他疫苗的载体蛋白质和佐剂，并且在科学研究中用作研究分子途径的工具。白喉毒素(DT)是由白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)的产毒菌株合成和分泌的蛋白质性毒素。产毒菌株含有携帯毒素基因的噬菌体溶素原。DT被合成为535个氨基酸的多肽，其经历蛋白水解以形成成熟的毒素。成熟的毒素包含由ニ硫键连接的两个亚基A和B。由完整DT的C末端部分形成的B亚基使DT能够结合细胞膜并通过细胞膜进入到胞质中。一旦进入细胞，由完整DT的N末端部分形成的酶的A亚基催化延伸因子2 (EF-2)的ADP核糖基化。其结果是，EF-2被灭活、蛋白质合成停止和细胞死亡。白喉毒素是高度细胞毒性的，单个分子可以致死细胞，且10ng/kg的剂量可以杀死动物和人。CRM197蛋白是DT的无毒的、免疫学交叉反应的形式。已研究了其作为DT增强剂或疫苗抗原的潜在用途。CRM197是通过由产毒的P棒状杆菌噬菌体的亚硝基胍诱变构建的非产毒噬菌体P 197tQX_感染的白喉杆菌产生的。CRM197蛋白具有与DT相同的分子量，但在A亚基中有单碱基变化(鸟嘌呤变为腺嘌呤)的差异。这ー单碱基变化导致氨基酸置换(谷氨酸置換为甘氨酸)，并消除了 DT的毒性性质。使用CRM197作为载体蛋白的结合多糖疫苗已批准人体使用。疫苗包括MenVe0 (Novartis Vaccines and Diagnostics)(标明用于预防由脑膜炎球菌亚群A、C、Y和W-135引起的侵袭性脑膜炎球菌疾病的疫苗)、Menjugate (Novartis Vaccines)(脑膜炎双球菌C群结合疫苗)、和Prevnar (Wyeth Pharmaceuticals, Inc.)(革巴向于肺炎链球菌的七种血清型的儿童肺炎疫苗)和HibTITER (Wyeth)(流感嗜血杆菌b型疫苗)。此外，CRM197具有用作白喉杆菌疫苗接种的增强抗原的潜力并正在研究作为用于其它疫苗中的载体蛋白。用于批准的治疗和研究用途的CRM197高水平表达的方法尚未见报道。CRM197已在例如白喉杆菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌中以数十mg/L的水平表达。单剂Prevnar结合疫苗含有大约20ii g CRM197。因此，用于经济地以约lg/L或以上的水平生产CRM197的方法将极大地促进疫苗研究和生产。由霍乱弧菌(Vibrio cholera)产生的霍乱毒素(CTX)是ー种导致以腹泻和呕吐为特征的感染的细菌性病原体，也是ー种ADP-核糖基化毒素。CTX是由六个蛋白质亚基组成的低聚复合物单ー拷贝的霍乱毒素A亚基(CTA)和五个拷贝的霍乱毒素B亚基(CTB)。这五个各重12kDa的B亚基形成了ー个五元环。A亚基具有Al部分CTAl和A2链CTA2，CTAl是将G蛋白进行ADP-核糖基化的球状酶，而CTA2形成紧靠地位于B亚基环中心孔中的伸展的a螺旋。该环结合到宿主细胞表面上的GMl神经节苷脂受体上，导致整个复合物的内化。一旦内化，CTAl链通过ニ硫键的还原释放。然后CTAl被激活并且催化腺苷酸环化酶的ADP核糖基化。由此导致的腺苷酸环化酶活性的增强提高了环AMP的合成，这导致大量的流体和电解质流出并且导致腹泻。CTX的B亚基尽管是相对无害的，但仍保留了其结合到GMl神经节苷脂受体上的能力。因此，CTB可用于促进化学地或遗传地偶联的外来抗原的粘膜摄取。已证实其诱导粘膜免疫和系统免疫，并且是用于可食用疫苗的生产的候选物。由于其结合偏好，CTB也可用作神经元示踪物。百日咳毒素(PTX) 是由导致百日咳病的人呼吸道细菌性病原体百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)产生的外毒素和毒力因子。百日咳全毒素是具有AB 5结构的多亚基复合物。酶活性的A亚基(SI)是修饰哺乳动物细胞内几种异三聚体G蛋白的a亚基的ADP-核糖基转移酶，而B低聚物(S2、S3、两个拷贝的S4和S5)结合细胞上的糖结合物受体。该毒素的五个亚基由百日咳类毒素操纵子表达。已研究了用于保护性疫苗和用作疫苗佐剂的百日咳毒素的无毒变异体。也需要百日咳毒素蛋白来用于研究，例如用于对G蛋白信号传导途径的研究。由破伤风梭菌(Clostridium tetani)产生的破伤风毒素是具有150kDa分子量的神经毒素。它由以下两部分组成100kDa重链或B-链和50kDa轻链或A-链。这些链通过ニ硫键连接。B链结合到位于神经元膜上的ニ唾液酸神经节苷脂(⑶2和⑶Ib)上。A链(一种锌内肽酶)攻击囊泡相关膜蛋白(VAMP)。A链的作用通过降解小突触泡蛋白阻止了受影响的神经元释放抑制性神经递质GABA( Y-氨基丁酸)和甘氨酸。其后果是最小刺激引起肌肉的危险的过度活动ー感官刺激对运动反射的抑制失败。这导致主动肌和拮抗肌肌肉组织的全身性收缩，被称为强直性痉挛。破伤风毒素C片段(Tet C或TTC)是通过破伤风毒素的蛋白酶切割(例如用木瓜蛋白酶)或通过片段的重组表达而产生的50kD的多肽。它对应于C-末端的451个氨基酸(氨基酸位置865-1315)。C片段已表明为无毒性的。因为它以高特异性和亲和カ与神经元结合，TTC可用作神经元药物递送的靶向分子或用于研究目的。TTC蛋白也可潜在地用作疫苗载体蛋白并且在疫苗中用来避免破伤风梭菌感染。艰难梭菌(Clostridium difficile)毒素B(TcdB)是由艰难梭菌产生的毒力因子，它导致医院获得性腹泻和假膜性结肠炎。TcdB和第二大梭菌毒素TcdA參与了假膜性结肠炎的发生。TcdB是约270kD的葡糖基化毒素，且可分成酶、易位和受体结合域。TcdB的前546个氨基酸包含酶区域，接着是推定的易位和受体结合域。TcdB具有作为艰难梭菌感染的保护性疫苗以及用于诊断检验及其开发的潜在用途。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素A (ETA或PE)是一种II型ADPRT。就像它的家族成员白喉毒素和霍乱毒素ー样,它通过细胞延伸因子2的ADP-核糖基化来抑制蛋白质合成。铜绿假单胞菌外毒素A作为单体存在，由613个氨基酸的单ー多肽链^6kd)组成。ETA可潜在地用作疫苗偶联物。ETA的无毒性突变体已作为用于防御金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、痕疾和伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhi)的疫苗接种的疫苗偶联物进行了研究。以足够满足不断扩大的需求的量来生产这些毒素已成为重大的挑战。当在常规蛋白质过表达系统中生产时，由于降本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·M·雷奥尔阿克，L·丘，H·金，H·W·塔尔伯特，
申请(专利权)人：菲尼克斯公司，
类型：
国别省市：