重组欧氏杆菌天冬酰胺酶的生产方法技术

本文提供了生产重组欧氏杆菌天冬酰胺酶的方法。本文的方法生产在宿主细胞的周质或细胞质中具有高表达水平的天冬酰胺酶，其活性与可商购的天冬酰胺酶制剂相当。

Production method of recombinant asparaginase

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】重组欧氏杆菌天冬酰胺酶的生产方法相关申请的交叉引用本申请要求2017年10月27日提交的美国临时申请号62/578,305的权益，其通过引用并入本文。序列表本申请包含序列表，其已经以ASCII格式电子提交，并且通过引用整体并入本文。所述ASCII副本创建于2018年10月16日，文件名为38194-749_601_SL.txt，大小为71,228字节。
技术介绍
来自细菌菊欧氏杆菌的L-天冬酰胺酶II型(也称为菊天冬酰胺酶(crisantaspase))被指出与其他化疗剂联合用于治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)的患者，其已发展出针对源自大肠杆菌的天然或聚乙二醇化的天冬酰胺酶的超敏反应或沉默失活。它也可用于治疗其他肿瘤性疾病。菊天冬酰胺酶是通过发酵菊欧氏杆菌以产生细胞糊状物而制备，细胞糊状物经过处理以产生酶制剂，该酶制剂通过一系列色谱法和其他方法进一步纯化以产生药物。当在欧氏杆菌中表达时，菊天冬酰胺酶前蛋白利用其在N-末端存在的天然分泌信号序列分泌到细胞的周质空间。一旦定位在周质空间内，信号序列被切割掉以产生能够自发地融合成四聚体或或活性形式的菊天冬酰胺酶的成熟单体。在某些情况下，使用具有来自异源的各种分泌信号肽的融合体，在大肠杆菌中表达重组菊天冬酰胺酶。
技术实现思路
本文提供了用于生产重组II型天冬酰胺酶的方法。在一些实施方式中，该方法包括：在培养基中培养假单胞菌目(Pseudomonadales)宿主细胞并从包含编码所述重组天冬酰胺酶的核酸的表达构建体在所述假单胞菌目宿主细胞的细胞质中表达所述重组天冬酰胺酶，其中所述重组天冬酰胺酶在所述细胞质中以约20％TCP至约40％TCP可溶天冬酰胺酶的产率产生。在一些实施方式中，重组天冬酰胺酶在细胞质中以约10g/L至约25g/L的产率产生。在一些实施方式中，该方法进一步包括使用活性试验测量所产生的一定量的可溶重组II型天冬酰胺酶的活性。在一些实施方式中，编码重组天冬酰胺酶的核酸被优化用于在宿主细胞中表达。在一些实施方式中，重组天冬酰胺酶是菊欧氏杆菌L-天冬酰胺酶II型(菊天冬酰胺酶)。在一些实施方式中，编码重组天冬酰胺酶的核酸包含与SEQIDNO:1至少85％同源的序列。在一些实施方式中，重组天冬酰胺酶具有与SEQIDNO:2至少85％同源的氨基酸序列。在一些实施方式中，重组天冬酰胺酶的表达通过向培养基中添加IPTG来诱导。在一些实施方式中，IPTG在培养基中的浓度为约0.05mM至约2.5mM。在一些实施方式中，当假单胞菌(Pseudomonad)宿主细胞已生长至约0.1g/g至约0.5g/g的湿细胞重量时，诱导重组天冬酰胺酶的表达。在一些实施方式中，假单胞菌目宿主细胞在约5.0至约8.0的pH下培养。在一些实施方式中，假单胞菌目宿主细胞在22℃至约33℃的温度下培养。在本文的任何实施方式中，假单胞菌目宿主细胞是荧光假单胞菌细胞。在一些实施方式中，假单胞菌目宿主细胞缺乏一种或多种天冬酰胺酶的表达。在一些实施方式中，假单胞菌目宿主细胞缺乏一种或多种天然天冬酰胺酶的表达。在一些实施方式中，缺乏表达的天然天冬酰胺酶是I型天冬酰胺酶。在一些实施方式中，缺乏表达的天然天冬酰胺酶是II型天冬酰胺酶。在一些实施方式中，假单胞菌目宿主细胞缺乏一种或多种蛋白酶的表达。在一些实施方式中，假单胞菌目宿主细胞过表达一种或多种折叠调节体。在一些实施方式中，假单胞菌目宿主细胞缺乏一种或多种天然天冬酰胺酶的表达，缺乏一种或多种蛋白酶的表达和/或过表达一种或多种折叠调节体。在实施方式中，该方法包括：在培养基中培养假单胞菌目宿主细胞并从包含编码重组天冬酰胺酶的核酸的表达构建体在假单胞菌目宿主细胞的周质中表达所述重组天冬酰胺酶；其中所述重组天冬酰胺酶在所述周质中以约20％至约40％TCP可溶天冬酰胺酶(例如单体天冬酰胺酶)的产率产生。在一些实施方式中，重组天冬酰胺酶在周质中以约5g/L至约20g/L的产率产生。在一些实施方式中，该方法进一步包括使用活性试验测量所产生的一定量的重组II型天冬酰胺酶的活性。在一些实施方式中，编码重组天冬酰胺酶的核酸被优化用于在宿主细胞中表达。在一些实施方式中，重组天冬酰胺酶是菊欧氏杆菌L-天冬酰胺酶II型(菊天冬酰胺酶)。在一些实施方式中，编码重组天冬酰胺酶的核酸包含与SEQIDNO:1至少85％同源的序列。在一些实施方式中，重组天冬酰胺酶具有与SEQIDNO:2至少85％同源的氨基酸序列。在一些实施方式中，重组天冬酰胺酶的表达通过向培养基中添加IPTG来诱导。在一些实施方式中，IPTG在培养基中的浓度为约0.05mM至约2.5mM。在一些实施方式中，当假单胞菌目宿主细胞已生长至约0.05g/g至约0.5g/g的湿重量时，诱导重组天冬酰胺酶的表达。在一些实施方式中，假单胞菌目宿主细胞在约5.0至约8.0的pH下培养。在一些实施方式中，假单胞菌目宿主细胞在22℃至约33℃的温度下培养。在一些实施方式中，假单胞菌宿主细胞是荧光假单胞菌细胞。在一些实施方式中，假单胞菌目宿主细胞缺乏一种或多种天然天冬酰胺酶的表达。在一些实施方式中，缺乏表达的天然天冬酰胺酶是I型天冬酰胺酶。在一些实施方式中，缺乏表达的天然天冬酰胺酶是II型天冬酰胺酶。在一些实施方式中，假单胞菌目宿主细胞缺乏一种或多种蛋白酶的表达。在一些实施方式中，假单胞菌目宿主细胞过表达一种或多种折叠调节体。在一些实施方式中，表达构建体包含分泌前导体。在一些实施方式中，分泌前导体选自假单胞菌目分泌前导体FlgI、Ibps31A、PbpA20V、DsbC、8484和5193。在一些实施方式中，分泌前导体指导所产生的重组天冬酰胺酶转移至假单胞菌宿主细胞的周质。在一些实施方式中，该方法进一步包括使用相同的活性试验将产生的重组II型天冬酰胺酶的测量的活性与相同量的对照II型天冬酰胺酶的测量的活性进行比较。在一些实施方式中，对照II型天冬酰胺酶包含已在至少一个国家被商业批准用于患者的欧氏杆菌II型天冬酰胺酶。在一些实施方式中，当产生的重组II型天冬酰胺酶具有II型天冬酰胺酶对照样品的约80％至约120％的活性时，选择所述产生的重组II型天冬酰胺酶用于患者。在一些实施方式中，重组II型天冬酰胺酶被修饰以增加在患者中的半衰期。在实施方式中，宿主细胞选自以下中的至少一种：缺乏HslUV蛋白酶的宿主细胞、缺乏PrtB蛋白酶的宿主细胞、缺乏Prc蛋白酶的宿主细胞、缺乏DegP蛋白酶的宿主细胞、缺乏AprA蛋白酶的宿主细胞、缺乏Lon蛋白酶的宿主细胞、缺乏La蛋白酶的宿主细胞、缺乏DegP1的宿主细胞、缺乏DegP2的宿主细胞和过表达DegPS219A的宿主细胞。通过引用并入本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都以如同每个单独的出版物，专利或专利申请被明确地并单独地指出通过引用并入的相同程度通过引用并入本文。附图说明在所附权利要求中具体阐述了本公开的新颖特征。通过参考以下阐述在其中利用了本公开的原理的说明性实施例的详细描述并结合附图，将获得对本公开的特征和优点的更好的理解：图1.SDS-CGE凝胶样图像本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于生产重组II型天冬酰胺酶的方法，所述方法包括在培养基中培养假单胞菌目宿主细胞并从包含编码所述重组II型天冬酰胺酶的核酸的表达构建体在所述假单胞菌目宿主细胞的细胞质中表达所述重组II型天冬酰胺酶，其中所述重组天冬酰胺酶在所述细胞质中以约20％TCP至约40％TCP可溶II型天冬酰胺酶的产率产生。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171027 US 62/578,3051.一种用于生产重组II型天冬酰胺酶的方法，所述方法包括在培养基中培养假单胞菌目宿主细胞并从包含编码所述重组II型天冬酰胺酶的核酸的表达构建体在所述假单胞菌目宿主细胞的细胞质中表达所述重组II型天冬酰胺酶，其中所述重组天冬酰胺酶在所述细胞质中以约20％TCP至约40％TCP可溶II型天冬酰胺酶的产率产生。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组II型天冬酰胺酶在所述细胞质中以约10g/L至约25g/L的产率产生。


3.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括使用活性试验测量所产生的一定量的所述可溶重组II型天冬酰胺酶的活性。


4.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组II型天冬酰胺酶是菊欧氏杆菌L-天冬酰胺酶II型(菊天冬酰胺酶)。


5.根据权利要求1所述的方法，其中编码所述重组II型天冬酰胺酶的所述核酸包含与SEQIDNO:1至少85％同源的序列。


6.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组II型天冬酰胺酶具有与SEQIDNO:2至少85％同源的氨基酸序列。


7.根据权利要求1所述的方法，其中所述假单胞菌目宿主细胞是荧光假单胞菌细胞。


8.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞缺乏一种或多种天然天冬酰胺酶的表达。


9.根据权利要求8所述的方法，其中所述一种或多种缺乏表达的天然天冬酰胺酶选自：I型天冬酰胺酶；II型天冬酰胺酶；及其组合。


10.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞：缺乏一种或多种蛋白酶的表达；过表达一种或多种折叠调节体；或两者。


11.一种用于生产重组II型天冬酰胺酶的方法，所述方法包括：
在培养基中培养假单胞菌目宿主细胞并从包含编码所述重组II型天冬酰胺酶的核酸的表达构建体在所述宿主细胞的周质中表达所述重组II型天冬酰胺酶，其中所述重组II型天冬酰胺酶在所述周质中以约20％至约40％TCP可溶天冬酰胺酶的产率产生。


12.根据权利要求11所述的方法，其中所述重组II型天冬酰胺酶在所述周质中以约5g/L至约30g/L的产率产生。...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·J·科尔曼，T·布鲁克，
申请(专利权)人：菲尼克斯公司，
类型：发明
国别省市：美国;US