本发明专利技术涉及在细菌宿主中生产重组蛋白的领域。其进一步涉及不使用变性和不需要重折叠步骤而从不溶性部分提取可溶性的活性重组蛋白。特别是，本发明专利技术涉及用于从细菌宿主获得高水平的可溶性重组1型干扰素蛋白的制备方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】优先权声明本申请根据35U.S.C. § 119(e)要求于2010年3月4日提交的美国专利申请序列号61/310，671的优先权。美国专利申请序列号61/310，671的内容在此通过引用全文并入。 序列表本申请包含通过EFS-Web以ASCII格式提交的序列表，该序列表在此通过引用整体并入本文。创建于2011年2月11日的所述ASCII拷贝被命名为38194601(2). txt，且大小为9，237字节。
技术介绍
许多异源重组蛋白在细菌系统中表达时以错折叠的不溶性形式(称为包涵体)产生。一般地，必须使用变性试剂以溶解包涵体中的重组蛋白。然后该蛋白必须在已对于蛋白质的适当折叠进行优化的条件下复性。在优化上花费的努力以及缓慢的重折叠过程和降低的过程产率增加了重组蛋白生产的成本和时间。干扰素表现出抗病毒、抗增殖、免疫调节和其它活性。几种不同类型的人干扰素(包括α、β和Y)已基于例如其抗病毒和抗增殖活性进行区分。干扰素的分泌通过信号(包括病毒、双链RNA、其它多核苷酸、抗原和有丝分裂原)诱导。干扰素_β是已在细菌中以重组形式表达的蛋白质的实例，其中它隔离在包涵体中。人干扰素-β Ib是分子量为约22kDa和由165个氨基酸残基组成的调节性多肽。它可以由机体中的许多细胞(特别是成纤维细胞)响应于病毒感染或对其它生物物质的暴露而产生。它结合多聚的细胞表面受体。产生性的受体结合导致细胞内事件的级联，从而导致干扰素_β诱导基因的表达和触发抗病毒、抗增殖和免疫调节活性。干扰素_β lb,具体地说Betaseron (h-IFN-β Ib C17S),已经被用于治疗疾病，包括多发性硬化(MS)、乙型肝炎和丙型肝炎感染、神经胶质瘤和黑素瘤。干扰素-β已经证明减少患有复发的和缓解的MS的患者遭受侵袭的次数。需要大量的干扰素_β Ib用于治疗用途。重组干扰素Ib已在哺乳动物细胞中以低水平生产，包括人成纤维细胞和CHO细胞。动物细胞表达通常受到包括更长的处理时间、容易发生培养物的污染、需要维持严格的培养条件和高昂的培养基成本的技术难题的阻碍。由于已发现糖蛋白成分一般对于干扰素β的活性不是必须的，研究已经转向在细菌表达系统(大肠杆菌)中表达重组蛋白。如已经注意到的，在大肠杆菌中生成的包涵体必须通过变性溶解，且干扰素β必须重折叠。重折叠(其为缓慢的)延长了处理时间、增加了成本且降低了产率。目前为止，用于在哺乳动物或细菌宿主细胞中快速和经济地产生高水平的可溶性重组干扰素-β而无需变性和重折叠步骤的方法尚未见描述。专利技术概述本专利技术涉及用于在荧光假单胞菌中表达干扰素和开发使用温和去垢剂和无需重折叠过程而从发酵产物提取活性蛋白的方法。特别地，本专利技术提供了用于产生重组I型干扰素蛋白的方法，所述方法包括通过培养包含表达构建体的假单胞菌或大肠杆菌宿主细胞表达重组干扰素蛋白，该表达构建体包含已经针对在所述宿主细胞中表达而优化的编码序列；裂解所述宿主细胞；从所述裂解步骤获得不溶性部分和可溶性部分；通过使所述不溶性部分经历非变性提取条件而对其进行提取；和从所述不溶性部分获得提取沉淀和提取上清液，其中在所述提取上清液中的重组蛋白以可溶性形式、活性形式或其组合形式存在而无需进一步进行复性或重折叠步骤。在实施方式中，所述非变性提取条件包括存在温和去垢剂。在某些实施方式中，所述温和去垢剂是两性离子去垢剂。在特定实施方式中，所述两性离子去垢剂是Zwittergent3-08、Zwittergent 3-10、Zwittergent3_12 或 Zwittergent 3-14。在实施方式中，所述非变性提取条件包括约O. 5%至约2%的Zwittergent 3_14。在某些实施方式中，所述温和去垢剂不是N-月桂酰基-肌氨酸(NLS)。在实施方式中，所述非变性提取条件包括温和去垢剂的存在且进一步包括离液剂和亲液盐(cosmotropic salt)。在某些实施方式中，所述离液剂是尿素或盐酸胍,和所述亲液盐是NaCl、KCl或(NH4) 2S04。在特定实施方式中，所述非变性提取条件包括约O. 5至约2%的Zwittergent3_14 ;约O至约2M的尿素；约O至约2M的NaCl ;且pH为约6. 5至约·8.5。在实施方式中，所述非变性提取条件包括约1%的ZWittergent3-14 ；2M的尿素；2M的NaCl ;且pH为约8. 2。在其它实施方式中，所述非变性提取条件还包括约1%至约40%w/v的固形物。在某些实施方式中，所述非变性提取条件还包括约5% w/v的固形物。在实施方式中，所述重组I型干扰素蛋白是干扰素-β、干扰素-α、干扰素-K、干扰素-τ或干扰素_ω。在特定实施方式中，所述重组I型干扰素蛋白是干扰素_β或干扰素-α。在实施方式中，所述重组I型干扰素蛋白是干扰素_β，且所述干扰素选自 人干扰素-Plb和人干扰素-β Ib C17S。在实施方式中，其中所述重组I型干扰素蛋白是干扰素-α，且所述干扰素-α选自人干扰素-a 2a和人干扰素-α 2b。在进一步的实施方式中，所要求保护的方法进一步包括测量所述不溶性部分和所述提取上清液部分中重组I型干扰素蛋白的量，其中所述提取上清液部分中检测的重组干扰素蛋白的量为所述不溶性部分中检测的重组干扰素蛋白的量的约10%至约95%。在其它实施方式中，所述方法进一步包括测量所述重组蛋白的活性，其中所述提取上清液部分中存在的重组蛋白的约40%至约100%测定为活性的。在相关的实施方式中，所述重组蛋白是干扰素_β，且所述活性重组蛋白的量通过Blue S印harose亲和柱层析、受体结合分析、抗病毒活性分析或细胞病变效应分析测定。在其它实施方式中，所述重组蛋白是干扰素-α、干扰素-K或干扰素_ω，且所述活性重组蛋白的量通过Blue Sepharose亲和柱层析、受体结合分析、抗病毒活性分析或细胞病变效应分析测定。本专利技术进一步提供了用于产生重组I型干扰素蛋白的方法，所述方法包括通过培养包含表达构建体的假单胞菌或大肠杆菌宿主细胞表达重组干扰素蛋白，该表达构建体包含已经针对在所述宿主细胞中表达而优化的编码序列；裂解所述宿主细胞；从所述裂解步骤获得不溶性部分和可溶性部分；通过使所述不溶性部分经历非变性提取条件而对其进行提取；和从所述不溶性部分获得提取沉淀和提取上清液，其中在所述提取上清液中的重组蛋白以可溶性形式、活性形式或其组合形式存在而无需进一步进行复性或重折叠步骤，其中所述重组蛋白是干扰素-β，且进一步其中所述非变性提取条件使用图4B中的信息优化。在实施方式中，所述提取上清液中的重组蛋白以约O. 3克每升至约10克每升的浓度存在。在其它实施方式中，所述宿主细胞在约I至20或更多升的体积中培养。在特定的实施方式中，所述宿主细胞在约I升、约2升、约3升、约4升、约5升、约10升、约15或约20升的体积中培养。在一个实施方式中，所述表达构建体包含诱导型启动子。在特定的实施方式中，所述表达构建体包含Iac启动子衍生物且干扰素的表达通过IPTG诱导。在实施方式中，所述宿主细胞生长于约25°C至约33°C的温度下，约5. 7至约6. 5的pH下，且当OD575达到约80至约160时添加IPTG达到约O. 08mM至约O.本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：J·艾伦，冯平华，A·帕特卡，K·L·黑尼，L·丘，L·L·P·森钱萨朗希，
申请(专利权)人：菲尼克斯公司，
类型：
国别省市：
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