【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】重组CRM197的高水平表达相关申请的交叉引用本申请要求2010年3月30日提交的题目为“重组CRM197的高水平表达”的美国专利申请序列号61/319，152的优先权。专利技术背景白喉毒素(DT)是由白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)的产毒菌株合成和分泌的蛋白质性毒素。产毒菌株含有携帯毒素基因的噬菌体溶素原。DT被合成为535个氨基酸的多肽，其经历蛋白水解以形成成熟的毒素。成熟的毒素包含由ニ硫键连接的两个亚基A和B。由完整DT的C末端部分形成的B亚基使DT能够结合细胞膜并通过细胞膜进入到胞质中。一旦进入细胞，由完整DT的N末端部分形成的酶的A亚基催化延伸因子2(EF-2)的ADP核糖基化。其结果是，EF-2被灭活、蛋白质合成停止和细胞死亡。白喉毒素 是高度细胞毒性的，单个分子可以致死细胞，且10ng/kg的剂量可以杀死动物和人。CRM197蛋白是DT的无毒的、免疫学交叉反应的形式。已研究了其作为DT增强剂或疫苗抗原的潜在用途。CRM197是通过由产毒的P棒状杆菌噬菌体的亚硝基胍诱变构建的非产毒噬菌体P 197tQX_感染的白喉杆菌产...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.03.30 US 61/319,152书中详细说明。參照下面给出的利用了本发明原理的说明性实施方式的详细说明和附图可以更好的理解本发明的特征和优势。图I.示例性的优化CRM197基因的氨基酸和DNA序列。A.氨基酸序列(SEQ IDNO: 1)B. DNA 序列(SEQ ID NO 2)图2. CRM197的高通量表达分析。用毛细管凝胶电泳(SDS-CGE)分析使用如图IB所示的DNA序列表达的CRM 197蛋白。测试的40个CRM197表达菌株的可溶性部分显示于由SDS-CGE数据产生的凝胶样图像。如表6中描述的菌株名称列于各道上方。荧光假单胞菌表达的CRM197在SDS-CGE上作为约为58kDa的单一条带迁移(箭头)。发明详述CRM197交叉反应物质197(CRM197)是由具有错义突变的DT基因产生的白喉毒素变异体。CRM197缺乏ADP-核糖基转移酶(ADPRT)活性，且因此是无毒的。CRM197的基因具有单碱基置換，导致谷氨酸替代甘氨酸结合在第52位残基上(见，例如Bishai等，1987，“High-Level Expression of a Proteolytically sensitive Diphtheria Toxin Fragmentin Escherichia coli，，，J. Bact. 169 (11) :5140-51, Giannini 等，1984, “The Amino-AcidSequence of Two Non-Toxic Mutants of Diphtheria Toxin CRM45 和 CRM197，，，NucleicAcids Research 12(10) :4063-9 和 GenBank Acc. No. 1007216A,全部通过引用引入本文)。可以通过本领域中已知的方法或通过在白喉杆菌或其它微生物中表达以低水平制备CRM197蛋白。可以从可由很多公开来源包括美国典型培养物保藏中心得到的产生毒素的菌株中获得天然存在的或野生型的白喉毒素。用于在白喉杆菌中产生CRM197蛋白的质粒系统由例如美国专利 No. 5，614，382,“Plasmid for Production of CRM Protein andDiphtheria Toxin”的描述,其以其整体通过引用引入。核苷酸序列可使用重组DNA技术(由例如Sambrook等，Molecular Cloning, aLaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 19899 描述)制备，且也可以基于由棒状杆菌噬菌体P携帯的白喉毒素的野生型结构基因的已知DT核苷酸序列通过定点诱变技术制备(參见，例如，Greenfield 等，1993, “Nucleotide Sequence of thestructural Gene for Diphtheria Toxin Carried by Corynebacteriophage 18，，， ProcNat Acad Sci80 :6953_7，其通过引用引入)。核苷酸序列可如本文其他地方所述进行优化。[0029]密码子优化在异源表达系统中，优化步骤可以提高宿主产生外源蛋白的能力。蛋白质表达是由一系列包括那些影响转录、mRNA加工及翻译的稳定性和起始的因素的许多因素控制的。多核苷酸优化步骤可以包括提高宿主产生外源蛋白能力的步骤，以及辅助研究人员有效地设计表达构建体的步骤。优化策略可以包括,例如,翻译起始区的修饰、mRNA结构元件的改变和不同密码子偏倚性的使用。优化核酸序列以提高在细菌宿主中异源蛋白的表达的方法在本领域中是已知的，并在文献中描述。例如，用于假单胞菌宿主菌株中表达的密码子优化描述在美国专利申请公开号2007/0292918，“Codon Optimization Method”中，其全部内容通过引用并入本文。因此，优化可以处理异源基因的多种序列特征中的任意ー种。作为具体的实例，稀有密码子引起的翻译中止可导致异源蛋白表达的降低。稀有密码子引起的翻译中止包括在目标多核苷酸中存在很少在宿主生物体中使用的密码子可能对蛋白质的翻译有负面影响，因为它们在可用的tRNA池中的缺少。提高宿主生物体中最佳翻译的方法包括可导致稀有 宿主密码子从合成的多核苷酸序列中去除的密码子优化。替代的翻译起始也可以导致异源蛋白表达的降低。替代的翻译起始可包含偶然地包含能够作为核糖体结合位点(RBS)发挥功能的基序的合成多核苷酸序列。这些位点可引起从基因内部位点起始截短蛋白的翻译。降低产生截短蛋白(其可能难以在纯化过程中去除)的可能性的ー种方法包括从优化的多核苷酸序列中消除推定的内部RBS序列。重复引起的聚合酶滑脱可以导致异源蛋白表达的下降。重复引起的聚合酶滑脱涉及表明会引起可产生移码突变的DNA聚合酶的滑脱或ロ吃(stuttering)的核苷酸序列重复。这样的重复序列也能引起RNA聚合酶的滑脱。在具有高G+C含量偏倚性的生物体中，可以有更高程度的由G或C核苷酸重复构成的重复序列。因此，降低引起RNA聚合酶滑脱的可能性的ー种方法包括改变G或C核苷酸的延伸重复序列。干扰ニ级结构也可能导致异源蛋白表达的下降。ニ级结构可以隔离RBS序列或起始密码子，且与蛋白质表达的下降相关。茎-环结构也可以參与转录中止和减弱。优化的多核苷酸序列在核苷酸序列的RBS和基因编码区中可以含有最少的ニ级结构以允许转录和翻译的改善。另ー种可能影响异源蛋白表达的特征是限制性位点的存在。可以通过除去可能干扰随后转录单位亚克隆到宿主表达载体中的限制性位点优化多核苷酸序列。例如，可以通过识别由宿主异源表达所需的氨基酸序列开始优化过程。可以从该氨基酸序列设计候选多核苷酸或DNA序列。在设计合成DNA序列时，密码子选择的频率可以与宿主表达有机体的密码子选择进行比较和稀有宿主密码子可以从合成序列中除去。此夕卜，合成的候选DNA序列可以被修饰以除去不想要的限制性酶切位点，以及添加或移除任何所需的信号序列、接头或非翻译区。可以分析合成DNA序列中可能会干扰的翻译过程的ニ级结构的存在，如G/C重复序列和茎-环结构。在候选DNA序列合成之前，可以检验优化的序列设计以确认该序列正确编码所需的氨基酸序列。最后，可以使用DNA合成技术合成候选DNA序列，如本领域中已知的那些合成技术。在本发明的另ー个实施方式中，可以使用宿主生物体如荧光假单胞菌中的通用密码子选择来优化异源多核苷酸序列的表达。可以评估在宿主表达系统中被视为对于特定氨基酸优选的稀有密码子的百分比和分布。5%和10%的选择率值可作为确定稀有密码子的临界值。例如，表I中列出的密码子在荧光假单胞菌MB214基因组中的计算出现率小于5%，因而通常避免用于在荧光假单胞菌宿主中表达的优化基因中。表.I荧光假单胞菌MB214中出现率低于5%的密码子SSS使用的密码子%出现率^ —GGly ~GGA3.26IIleATA3.05LLeuCTA1.78 CTT4.57 TTA1.89RArgAGA1.39 AGG 2.72CGA 4.99_S SerTCT _428_本发明考虑使用任何CRM197编码序列，包括已针对在所使用的假单胞菌宿主细胞中表达进行优化的任何序列。预想使用的序列可以进行任何程度的优化，包括，但不限干，优化以消除在假单胞菌宿主细胞中出现率小于5%的密码子、在假单胞菌宿主细胞中出现率小于10%的密码子、稀有密码子引起的翻译中止、推定的内部RBS序列、G或C核苷酸的延伸重复序列、干扰性ニ级结构、限制性位点或它们的组合。 此外，在本发明的实施中任何有用的分泌前导序列的氨基酸序列可以由任何合适的核酸序列编码。表达系统用于在假单胞菌宿主细胞以及可用于本发明的方法中的宿主细胞中表达异源蛋白质的方法(包...
【专利技术属性】
技术研发人员：D·M·雷塔拉克，L·周，H·金，
申请(专利权)人：菲尼克斯公司，
类型：
国别省市：
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