一种H1R高表达的重组HEK293细胞的构建方法，利用真核表达载体pEGFP-N1构建全长H1R基因真核表达载体pEGFP-N1-H1R，进而以其转染HEK293细胞，利用G418筛选得到高表达全长H1R的基因的工程细胞系HEK293-H1R，并证实该细胞系可将全长H1R的表达提高2.58倍，H1R高表达的HEK293-H1R重组细胞应用于抗过敏药物筛选。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于重组细胞
，涉及一种HlR高表达的重组HEK293细胞的构建方法。
技术介绍
G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors, GPCRs),又称为七次a螺旋跨膜蛋白受体(seven a -helices transmembrane segment receptors, 7TM receptors),是体内最大的蛋白质超家族。在结构上面它包括七个跨膜区段，它们与配体结合G蛋白分子开关后，通过与受体偶联的G蛋白的介导，使第二信使物质增多或减少，转而改变膜上的离子通道，引起膜电位发生变化。其作用比离子通道型受体缓慢，这类受体与G蛋白之间的偶联关系也颇为复杂；一种受体可以和多种G蛋白偶联，激活多种效应系统；也可同时和几种受体偶联或几种G蛋白与一种效应系统联系而使来自不同受体的信息集中于同一效应系统。组胺是一种小分子胺类物质。它是由组氨酸脱羧酶作用于L-组氨酸而合成，组氨酸脱羧酶在整个机体细胞内均有表达，包括中枢神经系统神经元、胃黏膜壁细胞、肥大细胞及嗜碱粒细胞。组胺通过组胺受体(Histamine receptor,HlR)调节机体功能,包括睡眠与觉醒周期，能量及内分泌稳定，识别及记忆，抗惊厥作用。组胺受体属G蛋白偶联受体(GPCR)家族成员，与其他单胺GPCR具有共同的保守序列。但序列同源性很低，在与组胺的亲和力上存在很大差异，通过偶联激活特异的G蛋白进行信号转导。HlR在多种细胞中表达，包括内皮细胞、平滑肌细胞，调节血管舒张和支气管收缩。研究表明，组胺在过敏性炎症中起关键性作用，长期以来人们认为组胺释放引起的炎性反应是由HlR介导的。HlR通过改变细胞内钙离子的浓度而将细胞外信号传递给第二信使传导系统并升高环腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)浓度而影响细胞生理功能。过敏是指由免疫机制诱导的高敏反应。过敏是体液(抗体)或者是细胞免疫机制介导的。在大多数情况下，可产生过敏反应的抗体属于IgE类，这些个体可以归类于患有 IgE-介导的过敏反应。然而，并非所有的“特异反应性”(atopy)个体都会发生与IgE相关的“过敏反应”。在非-IgE-介导的过敏反应中，抗体也可以属于IgG—类。HlR拮抗剂也称为抗组胺药，可用于因组胺释放所致的荨麻疹、变应性鼻炎，以及对过敏所致的瘙痒、水肿都有很好的抑制作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种HlR高表达的重组HEK293细胞的构建方法，采用以 HlR为靶标，筛选HlR阻断剂，为发现HlR阻断剂建立细胞模型。为了达到上述目的，本专利技术是通过以下技术方案来实现一种HlR高表达的重组HEK293细胞的构建方法，HlR高表达的重组HEK293细胞是以HEK293细胞为宿主细胞，转染宿主细胞的外源性表达载体的是包含HlR全长基因的表达载体。所述的HlR全长基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示。所述的包含HlR全长基因的表达载体是pEGFP-Nl，该表达载体是通过HindIII， Xho I酶切位点将Hl全长基因克隆入真核表达载体pEGFP-Nl。所述的表达载体pEGFP-Nl带有GFP绿色荧光，应用于HlR高表达细胞的筛选。所述的HlR高表达的HEK293-H1R重组细胞应用于抗过敏药物的筛选。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果I、本专利技术构建了组胺受体Hl的真核表达载体pEGFP-Nl，经过克隆测序证实序列同NCBI数据库中的人HlR序列一致；经过脂质体法转染HEK293细胞，G418抗性筛选获得能够稳定生长、存活的细胞株，经过Western blot,免疫荧光检测，筛选出稳定、高表达HlR 的重组HEK293/H1R细胞株；本专利技术构建的包含HlR基因全长的重组HEK293/H1R细胞株能够稳定表达H1R，具有完整的分子结构。2、作为宿主细胞的HEK293细胞为原代人胚肾细胞转染V型腺病毒(Ad5)DNA的永生化细胞，该细胞本身还有的各种受体表达量相对较低，而重组后的HEK293/H1R细胞表达的HlR的相对表达量较HEK293空载明显升高，相对于其他细胞表面分子占据优势表达量， 处于与特异配体结合的优势地位，这样就大大提高了以HlR为药物筛选靶标的特异性及灵敏性。3、重组后的HEK293/H1R细胞表达的HlR利用GFP融合蛋白，活体观察HlR蛋白表达定位，显示HlR蛋白主要表达于细胞膜上。4、通过Western blot及免疫荧光检测技术，证明HlR表达量相比HEK293明显升高，且其在细胞膜上的表达较HEK293细胞表达量明显提高，体现HlR的分子活性。附图说明图I是扩增HlR基因及线性化载体电泳检测图谱。图2是pEGFP-Nl/HIR重组载体转染大肠杆菌DH5后，提取质粒菌液PCR鉴定结果。图3是经G418抗性筛选后，通过GFP荧光蛋白，活体观察的阳性细胞培养图。图4-a是Western blot分析阳性细胞HlR表达量；图4_b是对Western blot结果灰度分析柱状图。图5是免疫荧光分析HlR在pEGFP-Nl/HIR细胞表达定位。具体实施例方式下面结合附图及实施例对本专利技术做详细描述。本专利技术在构建HlR全长基因的真核表达载体pEGFP-Nl/HIR的基础上，转染HEK293 细胞，获得稳定、高表达HlR的重组HEK293/H1R细胞株，下面是对本专利技术实施例的解释而不是限定。本实施例以pEGFP-Nl为基础载体，具体选择HindIII和XhoI酶切位点作为连接外源基因的多克隆位点。一种HlR高表达的重组HEK293细胞的构建方法，包括以下步骤I) HlR基因克隆选择包含HlR基因全长cDNA序列pBluescriptR/Hl质粒作为模板进行克隆，采用 Primer Premier5. 0软件设计相应的特异性引物,并在两端分别加入Hindlll/Xhol酶切位点HlR-HindIII :5’ -GATAAGCTTGGAGCGAATATGCAGAATTCT-3，HlR~XhoI :5’ -GTACTCGAGATG AGCCTCCCCAATTCCTCC-3’ ；采用Takara公司LA Taq进行扩增PCR反应体系为上游引物4 ii L、下游引物 4u LUOXM buffer 5u L.dNTP :8 y UDNA 1 u L、BSA :2 y UTaq 酶0. L、补加 ddH20 至 50 u L ;首次95°C变性5min,再经过30个循环作用(95°C变性45s，60。。复性40s, 72°C延伸 2min)，最后72°C延伸lOmin，得到大量目的片段，对产物采用商品化PCR纯化试剂盒将扩增产物纯化，HlcDNA扩增结果检测如图I所示，M为marker，结果表明扩增获得预期的基因；2)重组表达载体构建利用Hindlll/Xhol双酶切真核表达载体pEGFP_Nl和Hl基因纯化产物酶切体系为=HindIII 1 u L, Xho I 1. 5u L, DNA/质粒2u LUOXM buffer L、补加 ddH20 至 20 u L ;37°C反应4h，对pEGFP-Nl载体酶切产物采用商品化PCR产物纯化试剂盒将扩增产物纯化，pEGF本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：贺浪冲，张涛，黄静，郭瑛，
申请(专利权)人：西安交通大学，
类型：发明
国别省市：
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