一种基因共表达重组质粒及由该质粒制成的DNA疫苗制造技术

一种基因共表达重组质粒及由该质粒制成的ＤＮＡ疫苗，其特征在于依次包括鸡防御素－１基因片段的ＰＣＲ扩增过程、重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－Ｇａｌ－１的构建过程、鸡法氏囊病病毒ＶＰ２基因的ＰＣＲ扩增过程、鸡传染性法氏囊病病毒ＶＰ２基因与鸡防御素－１基因共表达重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－Ｇａｌ－１／ＶＰ２的构建过程、鸡传染性法氏囊病病毒ＶＰ２基因与鸡防御素－１基因共表达重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－Ｇａｌ－１／ＶＰ２培养过程提取过程。本发明专利技术与已有技术相比，具有防御素所特有的免疫增强作用的、适合鸡使用的、可用于预防鸡传染性法氏囊病的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种基因共表达重组质粒及由该质粒制成的DNA疫苗
-本专利技术涉及动物医药生物工程领域，是一种鸡传染性法氏囊病病毒 VP2基因与鸡防御素-1基因共表达DNA疫苗pcDNA3. 1 (+) -Gal-1/VP2。
技术介绍
传染性法氏囊病(infectious bumsl disease, IBD)是由传染性法 氏囊病病毒(infectious burasl disease virus, IBDV)弓t起的一禾中高 度接触性传染性疾病。主要侵害雏鸡和青年鸡的法氏囊，破坏法氏囊中的 B淋巴细胞，导致免疫抑制。使鸡对其他疫苗的免疫应答能力下降，对疾 病易感。自20世纪70年代传入我国以来，IBD在全国形成了几次流行爆 发，给我国的养鸡业造成沉重的打击。迄今为止，对于传染性法氏囊病仍无有效的治疗方法，通过免疫接 种提高鸡的抵抗力仍然是防制IBD的最佳选择。目前所研制的IBD疫苗 主要分灭活疫苗、活疫苗(分为弱毒型、中等毒力型和强毒型)、基因 工程苗和联苗等。现在普遍应用的仍然是活疫苗和灭活苗。人们为了防 制高致病力的IBDV，通常采用中等毒力或强毒株来研制疫苗。活疫苗毒 力太强或太弱都会影响最后的免疫效果。灭活疫苗需要使用剂量大，制 备需免疫佐剂，不能诱导机体产生细胞免疫。另外，疫苗的滥用、免疫 程序的不合理也很容易损伤鸡的法氏囊组织，导致免疫机能下降，免疫抑制，使鸡只对其他疾病的易感性提高，及对其他疫苗的免疫应答能力 下降。随着细胞工程和基因工程技术的发展，目前研究的热点已转向基 因工程疫苗的研制。研制一种安全有效的新型疫苗特别是基因工程疫苗 成为当前研究的热点。相对于传统疫苗，基因工程疫苗的生产完全在体 外进行，不需要以易感动物为载体来获得病毒制备活疫苗或者灭活苗； 疫苗不含有能够引起鸡群发病的成分，没有散毒的危险。很多学者一直致力于IBD的基因工程疫苗的研究。热点主要还是DNA疫苗和亚单位疫 苗。DNA疫苗是将含有编码抗原基因的质粒DNA直接导入体内，使抗原 基因在体内表达，诱导机体产生免疫应答，包括中和抗体、细胞毒淋巴 细胞和辅助T细胞(Hassett et al， 1996)。这种疫苗表达的蛋白能够 以天然抗原形式被免疫系统识别，热稳定性好，免疫力持久。IBDV属于双RNA病毒科禽双RNA病毒属。分为I型和II型两个血清 型。只有I型IBDV的某些毒株对鸡具有致病力。工BDV具有五种成熟蛋白， VP1、 VP2、 VP3、 VP4和VP5。其中VP2禾n VP3是主要的结构蛋白。VP2 位于多聚蛋白的N端，分子量约为40kD，由451个氨基酸残基组成，它 含有血清型特异性的能诱导中和抗体的抗原决定簇，是病毒的主要宿主 保护性免疫原(Hudson etal， 1986)。 VP2上的抗原决定簇为构象依赖 性的，其诱导的中和抗体能被动地保护宿主免受IBDV的感染(Azad et al， 1987; Becht et al， 1988)。同时VP2还是一种凋亡因子，能诱导 多种细胞凋亡(吕英姿，1999)。因此，在IBDV的分子生物学研究中， VP2蛋白的研究具有非常重要的地位。步志高等(2000)将D78株的VP2 基因插入真核表达质粒中，免疫SPF鸡。结果表明VP2基因DNA免疫能够诱导SPF鸡产生中和抗体，对IBDV超强毒株的攻击具有保护作用。 Pitcovski et al (2003)将VP2基因在Pichia pastoris表达系统中 表达，扩增后用其对鸡群进行免疫，取得良好的效果。Hulse et a1(2002) 将IBDV标准强毒株STC的VP2基因克隆到真核表达载体中，纯化质粒 DNA后胸部肌肉注射免疫2周龄雏鸡。结果在胸肌、胸腺、脾脏和法氏 囊中均可发现VP2基因，但在盲肠扁桃体中则没有。证明质粒DNA直接 注射鸡的胸肌后，在注射部位能转录和翻译目的基因，并能分布在一级 和二级淋巴组织中。姜平等(1998)用VP2、 VP3重组质粒DNA免疫14 日龄的仔鸡，结果表明，VP2基因重组质粒除了可诱导产生较高的ELISA 抗体之外，还可明显降低发病率和死亡率。单一抗原VP2 DNA疫苗预防 鸡传染性法氏囊病虽然效果不错，但也存在免疫反应性不够强、免疫原 性弱、保护力相对不够高等缺陷。如何更好的提高DNA疫苗免疫效果， 提高机体免疫应答水平，是当前DNA疫苗研究的关键问题。随着对细胞因子研究的不断深入，许多细胞因子发现具有明显的分 子免疫佐剂作用，可以增强抗原的免疫原性和反应原性。防御素就是机 体为对抗外源病原微生物产生的一类非特异性免疫因子。最近对防御素 的研究表明其在机体适应性免疫力和先天性免疫力的提高方面都具有 非常重要作用(Menendez A & Finlay B B，2007)，是生物机体免疫防 卫系统的一个重要组成部分。人3-防御素(hBD-l和hBD-2)在内源免 疫与获得性免疫反应中起重要作用，如对未成熟树状突细胞和记忆性T-细胞具有趋化性(Yangetal， 1999 ; Yang et al, 2000)。 Biragyn et al (2001)对鼠防御素多肽-2，3的研究也发现它们可以与鼠CCR6化学激动受体的结合，类似于炎症化学激动剂MIP3-a ，可以化学吸引 骨髓来源的未成熟细胞。Lillard et al (1999)在进行防御素诱导增 强机体获得性免疫力机制研究时发现，人防御素(HNPs)能显著增加血 清中抗原特异性IgG与IgM的水平；增强抗原特异性CD4+T细胞的增值 与IFN-Y、 IL-5、 IL-6、 IL-10的分泌;体外研究发现CD4+T提高CD3 e 刺激的脾脏与Peyer' s结CD4+T细胞的增值与T辅助细胞因子分泌；调 节LPS或CD3 e刺激的脾脏与Peyer' s结B或T细胞群共刺激分子的 表达。Tani et al (2000)体外用人a-防御素刺激鼠脾脏细胞可以促进其增值和细胞因子的产生；体内喂给小鼠可以提高IgGi、 IgG2a、 IgG2b抗体水平。这些研究结果都表明了防御素在内源性免疫力和获得性免疫力中具有重要作用。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的在于提供一种具有防御素所特有的免疫增强作用 的、适合鸡使用的、可用于预防鸡传染性法氏囊病的鸡传染性法氏囊病病 毒VP2基因与鸡防御素-1基因共表达DNA疫苗pcDNA3. 1 (+) -Gal-1/VP2。本专利技术是这样实现的，依次包括鸡防御素-1基因片段的PCR扩增过 程、重组质粒pcDNA3. 1(+)-Gal-l的构建过程、鸡法氏囊病病毒VP2基因 的PCR扩增过程、鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因与鸡防御素-1基因共表 达重组质粒pcDNA3. l(+)-Gal-1/VP2的构建过程、鸡传染性法氏囊病病毒 VP2基因与鸡防御素-1基因共表达重组质粒pcDNA3. 1 (+) -Gal-1/VP2培养 过程提取过程，鸡防御素-1基因片段的PCR扩增过程依次是1、 根据国内外已在GenBank中登录的鸡防御素基因-1基因序列分 别经多重比较后设计引物，根据真核表达载体pcDNA3. 1(+)上的酶切位点， 鸡防御素基因-1上游引物设计从去掉了前导肽处开本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鸡传染性法氏囊病病毒ＶＰ２基因与鸡防御素－１基因共表达重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－Ｇａｌ－１／ＶＰ２，其特征在于依次包括鸡防御素－１基因片段的ＰＣＲ扩增过程、重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－Ｇａｌ－１的构建过程、鸡法氏囊病病毒ＶＰ２基因的ＰＣＲ扩增过程、鸡传染性法氏囊病病毒ＶＰ２基因与鸡防御素－１基因共表达重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－Ｇａｌ－１／ＶＰ２的构建过程、鸡传染性法氏囊病病毒ＶＰ２基因与鸡防御素－１基因共表达重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－Ｇａｌ－１／ＶＰ２培养过程提取过程，　鸡防御素－１基因片段的ＰＣＲ扩增过程依次是：　１、根据国内外已在ＧｅｎＢａｎｋ中登录的鸡防御素基因－１基因序列分别经多重比较后设计引物，根据真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋）上的酶切位点，鸡防御素基因－１上 游引物设计从去掉了前导肽处开始，加上起始密码字ＡＴＧ及Ｈｉｎｄ　Ⅲ酶切位点；下游引物设计在基因末端，去除了终止密码字ＴＧＡ，并加上ＢａｍＨ　Ⅰ酶切位点，鸡防御素基因－１上、下游引物序列为：鸡防御素基因－１上游引物：　５’－ＣＧＡＡＧＣ ＴＴＡＡＡＣＣＡＴＧＧＧＡＡＧＧＡＡＧＴＣＡＧＡＴＴＧ－３’　鸡防御素基因－１下游引物：　５’－ＴＴＧＧＡＴＣＣＧＣＣＣＣＡＴＡＴＴＣＴＴＴＴＧＣ－３’；　２、以重组质粒ｐＧＥＭ－Ｔ－Ｇａｌ－１为模板，加入ＥｘＴａｑ　ＤＮ Ａ聚合酶、鸡防御素基因－１上下游引物、ｄＮＴＰｓ进行扩增反应，ＰＣＲ的反应体系为：１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ５μＬ，４×ｄＮＴＰｓ４μＬ，浓度均为２０μｍｏｌ／Ｌ的鸡防御素基因－１上、下游引物各１μＬ，ｐＧＥＭ－Ｔ－ｇａｌ－１质粒１μＬ，ｄｄＨ２Ｏ　３７．５μＬ，浓度为５μｍｏｌ／Ｌ的ＥｘＴａｑ　ＤＮＡ聚合酶０．５μＬ，反应过程依次为：ａ、９５℃处理３ｍｉｎ；ｂ、依次９４℃处理４５ｓ、５５℃处理４５ｓ、７２℃处理１ｍｉｎ；反应过程进行３０个循环；ｃ、７２℃延伸１０ｍｉｎ；即获得鸡防御素－１基因片段的ＰＣＲ产物，　鸡防御素－１基因片段序列：　ＡＴＧＧＧＡＡＧＧＡＡＧＴＣＡＧＡＴＴＧＴＴＴＴＣＧＡＡＡＧＡＧＴＧＧＣＴＴＣＴＧＴＧＣＡＴＴＴＣＴＧＡＡＧＴＧＣＣＣＴＴＣＣＣＴＣＡＣＴＣＴＣＡＴＣＡＧＴＧＧＧ ＡＡＡＴＧＣＴＣＡＡＧＡＴＴＴＴＡＣＣＴＣＴＧＣＴＧＣＡＡＡＡＧＡＡＴＡＴＧＧＧＧＣ，　重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－Ｇａｌ...

【技术特征摘要】
1、一种鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因与鸡防御素-1基因共表达重组质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1/VP2，其特征在于依次包括鸡防御素-1基因片段的PCR扩增过程、重组质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的构建过程、鸡法氏囊病病毒VP2基因的PCR扩增过程、鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因与鸡防御素-1基因共表达重组质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1/VP2的构建过程、鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因与鸡防御素-1基因共表达重组质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1/VP2培养过程提取过程，鸡防御素-1基因片段的PCR扩增过程依次是1、根据国内外已在GenBank中登录的鸡防御素基因-1基因序列分别经多重比较后设计引物，根据真核表达载体pcDNA3.1(+)上的酶切位点，鸡防御素基因-1上游引物设计从去掉了前导肽处开始，加上起始密码字ATG及Hind III酶切位点；下游引物设计在基因末端，去除了终止密码字TGA，并加上BamH I酶切位点，鸡防御素基因-1上、下游引物序列为鸡防御素基因-1上游引物5’-CGAAGCTTAAACCATGGGAAGGAAGTCAGATTG-3’鸡防御素基因-1下游引物5’-TTGGATCCGCCCCATATTCTTTTGC-3’；2、以重组质粒pGEM-T-Gal-1为模板，加入ExTaq DNA聚合酶、鸡防御素基因-1上下游引物、dNTPs进行扩增反应，PCR的反应体系为10×PCR Buffer5μL，4×dNTPs4μL，浓度均为20μmol/L的鸡防御素基因-1上、下游引物各1μL，pGEM-T-gal-1质粒1μL，ddH2O 37.5μL，浓度为5μmol/L的ExTaq DNA聚合酶0.5μL，反应过程依次为a、95℃处理3min；b、依次94℃处理45s、55℃处理45s、72℃处理1min；反应过程进行30个循环；c、72℃延伸10min；即获得鸡防御素-1基因片段的PCR产物，鸡防御素-1基因片段序列ATGGGAAGGAAGTCAGATTGTTTTCGAAAGAGTGGCTTCTGTGCATTTCTGAAGTGCCCTTCCCTCACTCTCATCAGTGGGAAATGCTCAAGATTTTACCTCTGCTGCAAAAGAATATGGGGC，重组质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的构建过程将鸡防御素-1基因片段的PCR产物用氛氯仿抽提纯化，乙醇沉淀，干燥后用TE溶解，鸡防御素-1基因片段的PCR产物用BamH I、Hind III进行双酶切处理，胶回收130bp的条带，以同样的方法对pcDNA3.1(+)质粒进行双酶切处理，胶回收5.4kb左右的DNA片断，取5μL双酶切后胶回收的鸡防御素-1基因片段及3μL双酶切后胶回收的pcDNA3.1(+)质粒，加入1μL 10×T4DNA连接Buffer，1μL的T4DNA连接酶，16℃连接18小时，将连接产物转化DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板上37℃培养，即完成重组质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的构建，鸡法氏囊病病毒VP2基因的PCR扩增过程依次包括1、根据国内外已在GenBank中登录的鸡法氏囊病病毒VP2基因序列分别经多重比较后设计引物，根据真核表达载体pcDNA3.1(+)上的酶切位点，鸡法氏囊病病毒VP2基因上游引物加上EcoR I酶切位点并加多1个碱基T用于ORF框的正确通读，下游引物设计在基因末端，加上终止密码字TGA并加上Xho I酶切位点，鸡法氏囊病病毒VP2基因上、下游引物为鸡法氏囊病病毒VP2基因上游引物5’-CGAAGCTTAAACCATGGGAAGGAAGTCAGATTG-3’鸡法氏囊病病毒VP2基因下游引物5’-TTGGATCCGCCCCATATTCTTTTGC-3’2、以重组质粒pGEM-T-VP2为模板，加入ExTaq DNA聚合酶、鸡法氏囊病病毒VP2基因上下游引物、dNTPs进行扩增反应，PCR的反应体系为10×PCR Buffer 5μL，4×dNTPs4μL，浓度均为20μmol/L的鸡法氏囊病病毒VP2基因上、下游引物各1μL，pGEM-T-VP2质粒1μL，ddH2O 37.5μL，浓度为5μmol/L ExTaq DNA聚合酶0.5μL，反应过程依次为a、95℃处理3min；b、依次94℃处理40s、56℃处理45s、72℃处理90s；b过程进行30个循环；c、72℃延伸10min，即可获得鸡法氏囊病病毒VP2基因的PCR产物，鸡法氏囊病病毒VP2基因序列ACGAACCTGCAAGATCAAACCCAACAGATTGTTCCGTTCATACGGAGCCTTCTGATGCCAACAACCGGACCGGCGTCCATTCCGGACGACACCCTAGAGAAGCACACTCTCAGGTCAGAGACCTCGACCTACAATTTGACTGTGGGGGACACAGGGTCAGGGCTAATTGTCTTTTTCCCTGGTTTCCCTGGCTCAATTGTGGGTGCTCACTACACACTGCAGAGCAATGGGAGCTACAAGTTCGATCAGATGCTCCTGACTGCCCAGAACCTACCGGCCAGCTACAATTACTGCAGGCTAGTGAGTCGGAGTCTCACAGTGAGGTCAAGCACACTCCCTGGTGGCGTTTATGCACTAAATGGCACCATAAACGCCGTGACCTTCCAAGGAAGCCTGAGTGAACTGACAGATGTTAGCTACAATGGGTTGATGTCTGCAACAGCCAACATCAACGACAAGATCGGGAACGTCCTAGTAGGGGAAGGGGTAACTGTCCTCAGCTTACCCACATCATATGATCTTGGGTATGTGAGACTCGGTGACCCCATTCCCGCTATAGGGCTCGACCCAAAAATGGTAGCAACATGTGACAGCAGTGACAGGCCCAGAGTCTACACCATAACTGCAGCCGATGATTACCAATTCTCATCACAGTACCAAGCAGGTGGAGTAACAATCACACTGTTCTCAGCTAATATCGATGCCATCACAAGCCTCAGTATCGGGGGAGAACTCGTGTTTCAAACAAGCGTCCAAGGCCTTATACTGGGTGCTACCATCTACCTTATAGGCTTTGATGGGACTGCGGTAATCACCCGAGCTGTGGCCGCAGACAATGGGCTAACGGCCGGCACTGACAACCTTAT...

【专利技术属性】
技术研发人员：张辉华，杨小梅，马保华，谢青梅，马静云，曹永长，毕英佐，
申请(专利权)人：佛山科学技术学院，
类型：发明
国别省市：44[中国|广东]