使用乙醇酸脱氢酶多亚基融合蛋白增加光合作用碳固定的方法技术

本发明专利技术涉及刺激植物生长和/或提高生物量产量和/或增加植物碳固定的方法，包括将一个或多个核酸引入植物细胞、植物组织或植物，其中引入核酸造成叶绿粒内从头表达由细菌多亚基乙醇酸脱氢酶亚基翻译融合形成的一个或多个有乙醇酸脱氢酶酶活性的多肽。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】农作物产量受很多因素影响，其中一方面是影响植物生产生物量能力的因素(光合作用，养分和水分的吸收)，和另一方面是影响植物抵抗某些压力，例如生物压力(昆虫，真菌，病毒…)或非生物压力(干旱，盐度，营养缺乏· · ·)能力的因素。影响植物生产生物量的一个重要因子是光合作用。通过光合作用的机理，植物俘获大气二氧化碳并转化为糖，然后纳入植物组织中，从而产生生物量。光合作用是地球上所有初级生产力的最终来源。大部分植物有光合作用机理，其中叶绿体蛋白质酶RuBisCo (核酮糖-1，5_ 二磷酸羧化酶/加氧酶)是主要的获取二氧化碳和将其转化成糖的酶。那些植物属于所谓的C3植物，包括一些最重要的农作物，例如水稻、小麦、大麦、马铃薯、油菜籽。C3植物光合作用机理的一个已知问题是碳固定效率在某些环境条件下不是最佳，其中部分碳固定通过称为氧化的RuBisCo其他活性，而丧失。 RuBisCO能催化核酮糖-1，5_ 二磷酸的羧化和氧化。两种活性之间的平衡主要取决于植物对某些环境条件反应后改变的叶中co2/o2比率。每个羧化反应生成两分子磷酸甘油酸盐，进入卡尔文循环，最终形成淀粉和蔗糖并产生核酮糖-1，5-二磷酸。氧化反应生成单分子的磷酸甘油酸和磷酸乙醇酸。后者通过光呼吸作用重新循环为磷酸甘油酸(LeegoodR.C.等，1995)。每生成两分子磷酸乙醇酸，释放一分子CO2，造成碳固定的净损失，最终降低糖和生物量的生成。氨在此反应中也损失，并需要通过叶绿体中能量消耗反应重新固定。已经报道克服光呼吸作用作为提高光合作用最大效率和增加产量的目标(Zhu等，2008)，并且迄今已描述一些尝试来降低植物中碳损失并因此提高糖和生物量生产。Kebeish等报道阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)中光呼吸作用的损失可通过向叶绿体中引入光呼吸作用中间物乙醇酸分解代谢的细菌通路来缓解(WO 03/100066 ;Kebeish R.等,2007)。作者首先将大肠杆菌(Escherichia coli)乙醇酸脱氢酶酶的三个亚基靶向阿拉伯芥叶绿体，然后引入大肠杆菌乙醛酸连接酶和大肠杆菌羟基丙二酸半醛还原酶以完成此通路，与内源光呼吸通路平行转化乙醇酸成甘油酸。五个大肠杆菌基因的逐步核转化产生其中叶绿素乙醇酸直接转化为甘油酸的阿拉伯芥植物。这些转基因植物生长更快，生产更多芽和根生物量，并包括可溶性更高的糖。PCT/EP2009/059843描述水稻植物中增加生物量生产和/或种子生产和/或碳固定的方法，其中水稻植物用大肠杆菌乙醇酸脱氢酶三个亚基(glcD, glcE和glcF)转化,没有后续引入大肠杆菌乙醛酸连接酶和大肠杆菌羟基丙二酸半醛还原酶。本专利技术目标是使用细菌多个亚基乙醇酸脱氢酶(GDH)在农作物中的翻译融合，避免耗费时间和多个转化或多个表达盒转化的繁琐过程。细菌(glcD，glcE和glcF)亚基已经与灵活接头以不同配置融合，并在大肠杆菌GDH缺陷株中检测，显示重组GDH多个亚基融合蛋白DEFp, EFDp和FDEp有活性。性能最好的构建体已经转入烟草(Nicotiana tabacum),水稻和油菜籽植物，并且转基因植物显示明显增加的生长和提高的光合作用率。本专利技术涉及植物中增加生物量生产和/或种子生产和/或碳固定的方法，所述方法包括向植物细胞基因组引入编码乙醇酸脱氢酶多亚基融合蛋白的核酸，其中所述引入所述核酸可从头表达有乙醇酸脱氢酶酶活性的合成多肽，并且其中所述一个多肽定位在所生成植物的叶绿体中。专利技术背景中，乙醇酸脱氢酶多亚基融合蛋白是由对乙醇酸脱氢酶活性必须的乙醇酸脱氢酶亚基组成的一个多肽，一般在这些亚基之间有肽接头。本专利技术中，我们选择适于将细菌glcD,glcE和glcF结构域共价连接成多蛋白形式的重复接头序列(Gly4Ser)3，而不干扰所需属性，例如正确折叠，溶解性和⑶H活性。另外，接头不应被植物细胞质中的蛋白酶切割，使叶绿体中多蛋白可过量表达。专利技术背景中，生物量是由单个植物或植物生长表面积产生的物质量。可以测量几个参数以测定生物量生产的增加。这些参数的示例是植物高度，叶片的表面积，芽干重，根干重，种子数目，种子重量，种子大小…。种子生产或种子产率能在 每个单独植物或植物生长的每个表面积测量。这些参数一般在土壤生长测定期或生长特定步骤后测量，例如在植物营养生长期结束时，并且对比根据本专利技术转化一个或多个核酸的植物和未转化一个或多个这种核酸的植物。植物碳固定的增加能通过测量气体交换和叶绿素荧光参数来测定。一种使用LI-6400系统(力高泰公司(Li-Cor))和生产商所提供软件的便利方法描述于R. Kebeish等，2007，并通过引用纳入本文。专利技术方法涉及的核酸编码有乙醇酸脱氢酶酶活性的一个多肽。乙醇酸脱氢酶活性能根据Lord J. Μ. 1972测定，使用本申请实施例6所述的技术。或者，可用缺失形成活性内源乙醇酸脱氢酶的三个亚基的大肠杆菌突变体进行互补分析。这些大肠杆菌突变体不能以乙醇酸作为唯一碳来源生长。当这些缺陷型突变体内过量表达酶使得细菌恢复在含有乙醇酸作为唯一碳来源的培养基上生长时，意味着该酶编码大肠杆菌乙醇酸脱氢酶的功能等价物。互补分析的方法和方式描述于Bari等，2004，并通过引用纳入本文。编码有乙醇酸脱氢酶酶活性的一个多肽的核酸分子可以通过重组DNA技术(如PCR)或化学合成方法生产。所述核酸分子的鉴定和分离可通过使用已知乙醇酸脱氢酶核酸分子的序列，或部分序列，或在这些分子的反义互补链情况中，例如通过根据标准方法杂交(见如 Sambrook 等，1989)0用于本专利技术目的的乙醇酸脱氢酶可以是任何天然产生的乙醇酸脱氢酶，或其任何活性片段或其任何变体，其中一些氨基酸(优选1-20氨基酸，更优选1-10，甚至更优选1-5)被替换、添加或删除，从而该酶保留乙醇酸脱氢酶活性。根据本专利技术，“核酸”或“核酸分子”理解为多核苷酸分子，其可以是DNA或RNA类型，优选DNA类型，并特定是双链。其可是是天然或合成来源。合成核酸由体外生产。这些合成核酸的示例是那些本专利技术所述有乙醇酸脱氢酶酶活性的多肽的编码密码子已经根据要在其中表达的宿主生物体优化(例如,通过将密码子替换为这种宿主生物体或宿主生物体所属组的密码子使用表内相较原始宿主更优选或最优选的密码子)。密码子优化方法为技术人员熟知。优选乙醇酸脱氢酶多亚基融合蛋白由细菌乙醇酸脱氢酶亚基的融合组成，更优选由大肠杆菌glc 操纵子的三个必要亚基(gi/1141710/gb/L43490. 1/EC0GLCC)的融合组成。最优选包括SEQ ID NO:2 (Glc D)，4 (Glc E)和6 (Glc F)的融合氨基酸序列的多肽，其中这些氨基酸序列可以通过接头连接。因此，包括ID NO: 1，3和5多核苷酸序列的核酸能用于操作本专利技术。本专利技术方法包括向植物细胞基因组引入编码有乙醇酸脱氢酶酶活性的乙醇酸脱氢酶多亚基融合蛋白的核酸，其中所述多肽包括在氨基酸序列水平分别与SEQ ID N0:2、4和6有至少60、70、80或90%序列相同性的序列，特定是至少95%、97%、98%或至少99%，其中引入核酸可从头表达有乙醇酸脱氢酶酶活性的一个多肽，并且其中所述活性定位在叶绿体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：F·库扎勒，G·内尔克，C·彼得汉森尔，S·希尔贝格，
申请(专利权)人：拜尔农科股份公司，
类型：
国别省市：