本发明专利技术涉及一株嗜热脱氮芽孢杆菌正烷烃末端降解途径中的嗜热长链烷醇醇脱氢酶的晶体结构。本发明专利技术利用大肠杆菌E.coli异源表达该醇脱氢酶。通过蛋白质纯化方法获得该酶的纯品。利用悬滴结晶法得到该酶适宜衍射的晶体。利用X射线衍射方法对该酶的晶体结构进行解析。结果表明，一个亚基中含有两个结构域，其被一个裂缝隔开。N-端结构域含有一对类似于罗斯曼折叠的α/β折叠。该结构域含有一个NAD+辅酶结合位点。C-端结构域含有一个脱氢奎尼酸盐合成酶类似的α结构域布局。一个金属铁离子结合到C-端结构域，并暴露于中间裂缝。这些结果能全方位反应该酶的空间构象，为进一步研究醇脱氢酶的结构与功能之间的关系、提高酶的降解活性提供理论上的指导。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及到用X射线晶体衍射方法确定的一种嗜热长链烷醇醇脱氢酶晶体结构，属于分子生物学和应用微生物学领域。
技术介绍
醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase, ADHs, EC I. I. I. I)是生物体内重要的氧化还原剂之一，很多醇类代谢都是通过醇脱氢酶催化完成的。在动物、植物、微生物、真核生物以及原核细菌中都已发现醇脱氢酶，至少有25个EC编号的酶被称为醇脱氢酶。醇脱氢酶能够催化醇类物质到醛类物质的可逆氧化。ADHs的底物范围很广，其所起到的生理学作用也是多种多样的。在微生物烷烃类物质的末端降解途径中，ADHs催化反应中的第二步，末端降解途径如图3所示。 在正烷烃类物质末端降解途径中，由烷烃加氧酶将烷烃氧化为长链烷醇，再由醇脱氢酶进一步脱氢为长链烷醛，生成的长链烷醛在醛脱氢酶的作用下脱氢生成长链脂肪酸。在长链脂肪酸辅酶A连接酶作用下生成长链烷酸辅酶A后进入三羧酸循环，最终完全氧化为二氧化碳和水。醇脱氢酶来源广泛，种类繁多。依赖NAD(P)H的醇脱氢酶，根据它们的分子性质和金属含量，能够分为三类。I型Zn2+依赖的长链醇脱氢酶(每个亚基含有约350个氨基酸残基)，如来自于大肠杆菌Escherichia coli的菌株K_12中的YqhD。II型不含有金属的短链醇脱氢酶(每个亚基中含有约250个氨基酸残基),如来自于栖热菌属的ThermusthermophiIus HB27中的醇脱氢酶即属于该型脱氢酶。III型含铁的/由铁激活的长链醇脱氢酶(每个亚基中含有385-900个氨基酸残基)，如来自于发酵单胞菌属的Zymomonasmobilis ZM4中的醇脱氢酶,该醇脱氢酶需要铁离子存在才能活化发挥功能，以及来自于大肠杆菌E. coli的菌株ECLl中的含铁的醇脱氢酶。不动杆菌属中菌株HOlN对于十六烷醇具有降解活性。从一些已知的烷烃降解细菌，如假单胞菌属 Pseudomonas fluorescens NRRL B-1244、假单胞菌属 PseudomonasbutanovoraATCC 43655、不动杆菌属Acinetobacter M-1,以及一些尚未了解具有降解经类物质功能的细菌，如土壤芽孢杆菌属Geobacillus stearothermophiIus LLD-R、热球菌属Pyrococcusfuriosus DSM 3638,以及黄杆菌属 Flavobacterium frigidimaris KUC-1,等菌株都表现出了对于短链长到中等链长(C2-C14)烷基醇的降解活性。然而，具有降解较长链长(C15及以上)烷基醇的醇脱氢酶到目前还没有报道。目前研究最为清楚的是酵母菌中的醇脱氢酶，其为四聚体，单个亚基肽链含有347个氨基酸残基，亚基分子量为35000。酵母醇脱氢酶对底物专一性强，对乙醇及其他直链伯醇活性较高，只对少数仲醇和侧链烷醇具有活性。在石油烃降解途径中，嗜热脱氮芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)NG80-2中的长链烷醇醇脱氢酶是十分重要的关键酶，其能够耐高温并高效利用烷烃单加氧酶的催化产物长链烷醇，使其进一步脱氢，提高烷烃降解途径中的催化效率；另一方面，它有着比长链烷烃单加氧酶更广泛的底物范围，不仅能够催化长链烷醇，还对短链醇有很高的催化能力。因此，对长链烷醇醇脱氢酶的研究不仅有利于深入了解嗜热脱氮芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrif icans) NG80-2降解长链烧烃途径的机制,为探索其它烧烃降解菌的代谢途径提供理论基础，对该酶构建高效表达工程菌株及大量纯化更具有广阔的工业应用前景和经济价值。经文献检索，未发现与本专利技术的嗜热长链烷醇醇脱氢酶的晶体结构相同的公开文献报道。
技术实现思路
本专利技术目的是为了更加深入了解嗜热脱氮芽孢杆菌(Geobacillusthermodenitrif icans) NG80-2中参与正烧烃末端降解途径中的嗜热长链烧醇醇脱氢酶的 结构与功能之间的关系，提供嗜热长链烷醇醇脱氢酶的晶体结构；本专利技术通过蛋白质表达、纯化和悬滴气相扩散结晶方法获得了该嗜热长链烷醇醇脱氢酶的晶体，并通过X射线衍射方法对醇脱氢酶的晶体结构进行了解析。本专利技术中涉及的嗜热长链烷醇醇脱氢酶，其可以广泛作用于C12-C3tl之间的长链烷醇，其底物范围为碳链长度大于16个碳原子的烷基醇、1，3_丙二醇、乙醛、异丙醇、异戊醇、丙酮、辛醛和癸醛。其中，该醇脱氢酶的最适底物为I-辛醇。该醇脱氢酶可以利用NAD+/NADP+作为辅因子。序列分析该醇脱氢酶属于III型醇脱氢酶。在石油烃降解途径中，长链烷醇醇脱氢酶是十分重要的关键酶，对该酶的研究为深入研究嗜热脱氮芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrif icans )NG80_2降解长链烧烃代谢途径的机制提供了更有利的证据，也为探索其它烷烃降解菌的代谢途径提供理论基础。同时，该酶的嗜热性及降解长链烷醇的能力具有重要的工业应用价值，可以应用于石油污染物和石油废水的处理过程及用于提高微生物石油采收率。本专利技术通过X射线衍射方法，确定嗜热脱氮芽孢杆菌(Geobacillusthermodenitrif icans) NG80-2中参与正烧烃末端降解途径中的嗜热长链烧醇醇脱氢酶的晶体结构。为进一步研究该醇脱氢酶的降解机理、理解其结构与功能之间的关系，及将该酶用于环境石油污染治理中提供理论上的指导。本专利技术所涉及的菌株为嗜热脱氮芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrif icans)NG80-2，该菌株于2004年10月09日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No. 1228，该菌株已公开在专利号为ZL200410072759. 7、专利技术名称为《嗜热脱氮芽孢杆菌及其筛选和应用》的中国专利技术专利中。本专利技术提供的嗜热脱氮芽孢杆菌内的嗜热长链烷醇醇脱氢酶，其晶体结构如下一个亚基中含有两个结构域，这两个结构域被一个裂缝隔开。N-端结构域含有一对类似于罗斯曼折叠的α/β折叠，其中包含β折叠1-5和β折叠8，α螺旋1_4位于侧面；该结构域含有一个NAD+辅酶结合位点。C-端结构域含有一个脱氢奎尼酸盐合成酶类似的α结构域布局，其中9个α螺旋排成了一个螺旋束。一个金属铁离子结合到C-端结构域，并暴露于中间裂缝。该金属铁离子处于由四个严格保守的残基Aspl94，Hisl98，His261和His267所构成的金字塔形式的氢键网络之中。上述的醇脱氢酶的活性中心结构特征为在N-端结构域和C-端结构域中间有一条裂缝，有一个通道通往该裂缝。这个裂缝为底物提供了一个入口，并且使其能够接触到NAD+辅酶和金属结合位点。然而，该长链烷醇醇脱氢酶在之前的功能研究中并未表明其需要铁来使其发挥活性(Liu et al. , 2009, Microbiology 155:2078-85)。本专利技术所述的嗜热长链烷醇醇脱氢酶的晶体结构，经如下步骤得到I、蛋白酶的表达将含有该醇脱氢酶基因的重组质粒的大肠杆菌E. coli的菌液，接种到5ml经过灭菌且添加100mg/l kanamycin抗生素的LB液体培养基中,在37°C摇床中过夜培养1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株嗜热脱氮芽孢杆菌内的嗜热长链烷醇醇脱氢酶，其特征在于该嗜热长链烷醇醇脱氢酶的晶体结构如下：其空间群为C2221，晶胞参数为α=β=γ=90°；其为二聚体，一个亚基中含有两个结构域，这两个结构域被一个裂缝隔开；N？端结构域含有一对罗斯曼折叠类似的α/β折叠，其中包含β折叠1？5和β折叠8，α螺旋1？4位于侧面，N？端结构域含有一个NAD+辅酶结合位点；C？端结构域含有一个脱氢奎尼酸盐合成酶类似的α结构域布局，其由9个α螺旋排成了一个螺旋束，一个金属铁离子结合到C？端结构域，并暴露于中间裂缝，该金属离子处于由四个严格保守的残基Asp194、His198、His261和His267所构成的金字塔形式的氢键网络之中。FDA00002555442400011.jpg
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：马克·巴特兰姆，王莹莹，纪玉蕊，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：
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