一株低产高级醇的葡萄酒酵母制造技术

本发明专利技术涉及一株低产高级醇的葡萄酒酵母；是在培养酵母的平板中添加一定量的氯乙酸异戊酯，氯乙酸异戊酯在酵母菌乙酸异戊酯水解酶催化下生成氯乙酸，氯乙酸对酵母菌的生长具有强烈的抑制作用，如果突变菌株的酯分解酶活性大（酯酶分解酶活性大，菌株生成的高级醇多），进而分解产生的氯乙酸就多，所以菌落在氯乙酸的抑制作用下长的就会很小，利用本发明专利技术可以准确、方便、快速的筛选出低产高级醇的酵母菌种。利用本发明专利技术选育的低产高级醇酵母菌种生产葡萄酒，可以使葡萄酒中高级醇的含量降低10%～15%左右。利用本发明专利技术选育的高级醇低产菌株进行酒精发酵可有效降低葡萄酒中高级醇的含量，提高葡萄酒的保健价值。

【技术实现步骤摘要】
一株低产高级醇的葡萄酒酵母(-)
本专利技术涉及一株低产高级醇的葡萄酒酵母，属于葡萄酒酿造领域。(二)
技术介绍
高级醇在葡萄酒中是最为常见的酵母次生代谢物，如果酒中含量过高会导致消费者饮用后上头、头疼和醉酒，严重影响葡萄酒的保健效果。葡萄酒酵母代谢产生的高级醇主要有异戊醇、异丁醇、正丙醇和异己醇，其中异戊醇在葡萄酒高级醇组成中约占40%~50%。已有研究主要通过重氮染色平板法筛选低产高级醇酵母菌株来降低葡萄酒高级醇的含量。重氮染色平板显色原理:酵母菌乙酸异戊酯水解酶催化平板上的1-乙酸萘酯生成萘酚，后者与偶氮盐(固蓝盐B)反应，生成偶氮色素呈红色。当底物(1-乙酸萘)浓度一定时，酯酶活力越高，产物萘酚的量越大，生成的偶氮色素越多，酵母菌落颜色越深，高级醇生成量越大。目前商业酵母的酯分解酶活性比较低，而且是经过多次驯化才用于工业生产，如果再进一步对这些菌种进行改造，酯分解酶活性变化幅度不是很大。如果用重氮染色平板法对其进行筛选，出发菌株与目的菌株之间的显色差异不明显，不利于突变菌株的挑选。所以为酿造低高级醇葡萄酒，寻找一种快速、准确、方便的筛选低产高级醇酵母菌的方法很有必要。(三)
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株低产高级醇的葡萄酒酵母，并提供了一种快速、准确、方便的选育低产高级醇酵母菌的方法，利用该酵母生产葡萄酒可解决葡萄酒中高级醇含量过高而使消费者饮后上头、头疼的问题。本专利技术专利解决这个问题的途径是选用氯乙酸异戊酯平板筛选法。其原理是:在培养酵母的平板中添加一定量的氯乙酸异戊酯，氯乙酸异戊酯在酵母菌乙酸异戊酯水解酶催化下生成氯乙酸，氯乙酸对酵母菌的生长具有强烈的抑制作用，如果突变菌株的酯分解酶活性大(酯酶分解酶活性大，菌株生成的高级醇多)，进而分解产生的氯乙酸就多，所以菌落在氯乙酸的抑制作用下长的就会很小，利用本专利技术可以准确、方便、快速的筛选出低产高级醇的酵母菌种。利用本专利技术选育的低产高级醇酵母菌种生产葡萄酒，可以使葡萄酒中高级醇的含量降低10%~15%左右。本专利技术利用普通酿酒酵母分离培育出一株低产高级醇的葡萄酒酵母CP1118(Saccharomyces cerevisiae),经实验证明其具有降低葡萄酒中高级醇的能力。一株低产高级醇的葡萄酒酵母CP1118 (Saccharomyces cerevisiae)已于2013年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC);保藏编号:CGMCC N0.7828。保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所[0011 ]分类命名:酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。一株低产高级醇的葡萄酒酵母，通过以下方法制备得到:a.用接种环挑取一环商业葡萄酒酵母菌体作为出发菌株，接种到20mL YH)液体培养基中，30°C振荡培养16~18h ；b.然后取ImL步骤a培养后的YPD液体培养基12000r/min离心15s，弃上清液收集酵母细胞；再用无菌水洗涤收集到的细胞I次；c.用ImL pH值为7.0无菌磷酸钠缓冲液(磷酸二氢钠、磷酸氢二钠与无菌水的混合液；缓冲液的浓度0.lmol/L)，悬浮细胞；向悬浮后的细胞中加入30 μ L甲基磺酸乙酯(EMS)原液，振荡分散细胞，置于30°C摇床培养Ih后12000r/min离心15s ；d.向步骤c离心后的细胞中加入ImL浓度为5%的无菌Na2S2O3溶液(Na2S2O3与无菌水的混合液)洗涤细胞两次，以失活EMS的突变作用。e.收集步骤d)洗涤后的细胞，再用无菌水洗两次，后将细胞涂布氯乙酸异戊酯平板(CL平板)，30°C培养3天后挑选菌落最大者即为高级醇低产菌株(目的菌株)。将目的菌株命名为 CP1118 (Saccharomyces cerevisiae)。对菌株CP1118 (Saccharomyces cerevisiae)进行遗传稳定性试验并进行高级醇生成量检测，证明该菌株传代培养后，仍具有降低高级醇生成量的作用，说明其遗传性状稳定。通过高级醇生成量分析，确定目的菌株高级醇的生成量比出发菌的高级醇生成量明显降低。该菌株的主要生物学特征为:呈卵圆形或圆形。菌落呈乳白色，表面湿润、粘稠，不透明，边缘整齐，易被挑起。该菌株最适宜的生长条件为pH值7.0，温度30°C。本专利技术的有益效果:利用本专利技术选育的高级醇低产菌株进行酒精发酵可有效降低葡萄酒中高级醇的含量，提高葡萄酒的保健价值。(三)【附图说明】图1出发菌株葡萄酒高级醇测定气相色谱图以此为基准计算出出发菌株高级醇的生成量；图2目的菌株葡萄酒高级醇测定气相色谱图以此为基准计算出目的菌株CPl118高级醇的生成量；(四)【具体实施方式】下面结合具体实施案例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此:本专利技术可使用普通商业葡萄酒酵母作为出发菌株。YH)液体培养基:I %酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖、用蒸馏水溶解；在121°C下灭菌15min ;pH自然；YPD固体培养基:1%酵母提取物、2%的琼脂粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖、用蒸馏水溶解；氯乙酸异戊酯平板(CL平板)培养基:0.67%的酵母氮源基础、2%的葡萄糖、2%琼月旨、90mg/L氯乙酸异戍酯；用蒸懼水溶解并调至pH7.0。实施例1:低产高级醇葡萄酒酵母的选育I)出发菌株的诱变:a.从葡萄酒酵母EC1118斜面上用接种针挑取少量酵母菌体作为出发菌株，接种到盛有20mL YPD液体培养基中，在30°C下振荡培养16~18h，得到出发菌株菌液。b.然后取ImL出发菌株菌液于离心管中12000r/min,离心15s收集细胞，用无菌水洗漆I次。c.用ImL pH值为7.0无菌磷酸钠缓冲液(磷酸二氢钠、磷酸氢二钠与无菌水的混合液；缓冲液的浓度0.lmol/L)悬浮细胞，加30 μ L甲基磺酸乙酯(EMS)原液，振荡分散细胞，置于30°C摇床培养Ih后离心。d.然后向离心管中加入与步骤c离心管中离心后的液体等体积的浓度为5%无菌Na2S203溶液后离心去上清液，重复操作2次，以失活EMS的突变作用。2)目的菌株的筛选:a.取步骤l)d中离心收集的细胞，然后再用无菌水洗二次并调整到稀释溶液中酵母细胞浓度为IO3个/mL时，即得到菌悬液；吸取30微升菌悬液涂布氯乙酸异戊酯平板(CL平板)，30°C培养3天，挑选菌落最大者即为高级醇低产菌株(目的菌株)。将此目的菌株命名为CPl 118并进行遗传稳定性试验。3)目的菌株的遗传稳定性试验a.将CP1118用接种环接种一环到YPD固体培养基中，持续培养2天，得到一代CP1118 ;再用接种环接种一环一代CP1118到新的YPD固体培养基中，持续培养2天，得到二代CP1118;以此类推，连续传代培养10次；b.将传代培养至第10代的CPl118于Yro液体培养基中，28°C摇床培养2天，得到酵母菌CPl118菌液。c.用无菌水将酵母菌CPl118菌液稀释到浓度为IO6个/mL。然后吸取ImL稀释的酵母菌CPl118菌液于灭菌的50mL葡萄汁中进行发酵，同时取ImL出发菌株菌液加入50mL同样的葡萄汁中发酵作为对照组；两组发酵条件相同；发酵结束后(至残糖含量低于4g/L)对两组葡萄汁进行本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株保藏号为CGMCC?NO.7828的低产高级醇的葡萄酒酵母CP1118，于2013年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

【技术特征摘要】
1.一株保藏号为CGMCC N0.7828的低产高级醇的葡萄酒酵母CP1118，于2013年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。2.如权利要求1所述的葡萄酒酵母在降低葡萄...

【专利技术属性】
技术研发人员：翟衡，秦伟帅，张娜，杜远鹏，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：