醇脱氢酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种醇脱氢酶突变体，为野生型醇脱氢酶的氨基酸发生如下任意一种情况的突变：野生型醇脱氢酶的序列中第35位丝氨酸突变为天冬氨酸；野生型醇脱氢酶的序列中第35位丝氨酸突变为天冬氨酸，且第36位精氨酸突变为异亮氨酸；野生型醇脱氢酶的序列中第34位丙氨酸、缬氨酸、或半胱氨酸突变为异亮氨酸，且第35位丝氨酸突变为天冬氨酸，且第36位精氨酸突变为异亮氨酸；野生型醇脱氢酶的序列中第13位丝氨酸突变为丙氨酸，且第34位丙氨酸、缬氨酸、或半胱氨酸突变为异亮氨酸，且第35位丝氨酸突变为天冬氨酸，且第36位精氨酸突变为异亮氨酸；所述的野生型醇脱氢酶的序列如SEQ?ID?NO：2、4、6或8中的任意一项所示。

【技术实现步骤摘要】
醇脱氢酶突变体及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种可用作手性醇合成催化剂的醇脱氢酶(Alcohol Dehydrogenase, ADH)突变体及其应用。
技术介绍
手性醇(Chiral Alcohols)在手性药物、农用化学品以及多种类型的手性材料制备中有广泛应用。以(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯[(S)-CHBE]为例，(S)-CHBE可用于很多活性药物的合成，它是对映体选择性合成Slagenins B和C以及他汀类药物一羟甲基戊二酰CoA (HMG-CoA)还原酶抑制剂的关键手性中间体，而且(S)-CHBE还可以转化生成1，4-二氢吡啶类(6-阻滞剂[I]。 羰酰还原酶生物催化法不对称还原COBE制备(S) -CHBE法因其高效率、高立体选择性、反应条件温和以及经济和社会效益好等优点受到普遍关注[2]。然而，该反应的进行需要消耗一定量的辅酶一NAD (P)H。这类还原态辅酶往往价格昂贵且稳定性低，从技术经济角度考虑，生产中投加大量辅酶是不可行的，因此辅酶的高效原位再生成为了发展应用氧化还原酶工业生物催化技术的瓶颈问题。为了解决辅酶再生的问题，已经提出了酶法、光化学法、电化学法等一系列的方法[3]，其中酶法再生系统因其具有反应速率快、选择性高、再生体系与合成体系兼容性好、过程易于监控等优点而受到广泛重视，迄今已报道了多种脱氢酶、氧化酶、氢化酶参与实现的辅酶再生系统，其中甲酸脱氢酶(Formate dehydrogenase, FDH)是公认的烟酰胺型还原态辅酶再生系统的首选用酶[4-5]。甲酸脱氢酶催化甲酸生成CO2和H2O,伴随一分子的NAD+还原为NADH。该反应的底物甲酸廉价易得，且对合成体系的酶影响较小，而生成产物CO2易于分离，使反应接近不可逆过程，有利于提高酶转化效率，此外研究表明FDH适宜pH范围广泛，易于实现再生系统与合成系统的有效耦联。然而由于该体系只能实现NADH的再生，而短链脱氢酶家族中不少酶都是NADPH依赖型。随着分子生物学技术和蛋白质结构组学研究的日益发展，采用蛋白质工程技术改变酶的辅酶依赖型，从而很好地与甲酸脱氢酶偶联应用于辅酶再生体系，是近年来该领域的主要研究方向。目前已有不少文献报道了通过定点突变手段实现酶的辅酶特异性的改变。早期的文献报道大多采用序列比对等较为经验性的方式获得突变位点，Katzberg等以酵母还原酶Gre2p为研究对象，将其序列与赭色掷孢酵母羰基还原酶SSCR的序列进行比对，选择Asn9作为突变位点，采用定点突变技术，获得突变体N9E，研究该突变酶的辅酶特异性发现，NADH/NADPH的值为0.9，而其野生型的值仅为0.007 [6]。采用类似的位点选择方法的报道还有Zhang等2008年对来自近平滑念珠菌的羰基还原酶SCR所作的研究，选择了辅酶结合位点附近的Ser67，His68, Pro69作为突变位点。结果显示，双位点突变酶S67D/H68D在保留了酶的稳定性与立体选择性的基础上，其辅酶依赖型由NADPH依赖型变为更倾向于依赖NADH[7]。随着生物信息学，蛋白质结构生物学等领域的快速发展，对辅酶结合域的研究越发理性化，越来越多的报道采用计算机辅助技术对蛋白质的结构进行理性设计改造。大连科技大学2010年就研究发表了有关通过理性设计改变辅酶特异性的报道。文献报道了经通过自由能计算判断酶与辅酶的结合情况的方式，并釆用丙氨酸筛选突变以确定影响辅酶特异性的关键位点。在充分的理论分析与理性设计后，获得Asp41Gly，Asp41Ala两个突变体，结果显示突变酶的辅酶特异性均发生显著改变。从结构上分析该现象的结构性原理显示突变后削弱了 Asp41与磷酸基团之间的酯化作用[8]。同样的Morikawa等通过计算机辅助手段对来自木兰假丝酵母的SI进行研究，经虚拟筛选等理性设计最终获得的突变酶彻底失去了原本利用NADPH的能力，但其催化活性却只保留了野生型的14%[9]。综上所述，现有的关于辅酶特异性改造的研究已得到进一步的发展，但就现有的研究成果而言，釆用理性设计的研究并不多，改造后酶的活性大多出现不同程度的损失，辅酶特异性发生一定的改变却不能彻底改变等，这些方面都有较大的发展空间。参考文献:[I] Lee SHj Park 0J.Uses and production of chiral3-hydroxy- Y-butyrolactones andstructurally related chemicals[J].Appl MicrobiolBiotechnol，2009，84:817 ~828.[2] Yasohara Y, Kizaki N, Hasegawa J，Takahashi S，Wada M，Kataoka M, ShimizuS.Synthesis of optically activie ethyl4-chloro-3-hydroxybutanoate by microbialreduction[J].Appl Microbiolo Biotechnol，1999，51:847 ~851.[3]Bergel, A.，Comtat，M.，Electroenzymatic reactors with coenzymeregeneration:Atheoretical approach[J].Biotechnol Bioeng，1986,28 (5):728-735.[4]Van der Donk W.A., Zhao H., Recent developments in pyridine nucleotideregeneration[J].Curr Opin Biotechnol, 2003，14(4):421-426.[5]Wichmann R.,Vasic-Racki D., Cofactor regeneration at the labscale[J].Adv BiochemEng Biotechnol，2005，92:225-260.[6] Katzberg M.，Skorupa-Parachin N.，Gorwa-Grauslund M.F.，BertauM.，Engineeringcofactor preference of ketone reducing biocatalysts: amutagenesis study on a Y-diketonereductase from the Yeast saccharomycescerevisiae serving as an example[J].1nt J Mol Sci，2010，11 (4):1735-1758.[7] Zhang R.，Xu Y.，Sun Y.，Zhang W., Xiao R., Ser67Asp and His68Aspsubstitutions inCandida parapsilosis carbonyl reductase alter the coenzymespecificity and enantioselectivityof ketone reduction[J].Appl EnvironMicr本文档来自技高网...

【技术保护点】
醇脱氢酶突变体，为野生型醇脱氢酶的氨基酸发生如下任意一种情况的突变：（1）野生型醇脱氢酶的氨基酸序列中第35位丝氨酸突变为天冬氨酸；（2）野生型醇脱氢酶的氨基酸序列中第35位丝氨酸突变为天冬氨酸，且第36位精氨酸突变为异亮氨酸；（3）野生型醇脱氢酶的氨基酸序列中第34位丙氨酸、缬氨酸、或半胱氨酸突变为异亮氨酸，且第35位丝氨酸突变为天冬氨酸，且第36位精氨酸突变为异亮氨酸；（4）野生型醇脱氢酶的氨基酸序列中第13位丝氨酸突变为丙氨酸，且第34位丙氨酸、缬氨酸、或半胱氨酸突变为异亮氨酸，且第35位丝氨酸突变为天冬氨酸，且第36位精氨酸突变为异亮氨酸；其中，所述的野生型醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2、4、6或8中的任意一项所示。

【技术特征摘要】
1.醇脱氢酶突变体，为野生型醇脱氢酶的氨基酸发生如下任意一种情况的突变: (1)野生型醇脱氢酶的氨基酸序列中第35位丝氨酸突变为天冬氨酸； (2)野生型醇脱氢酶的氨基酸序列中第35位丝氨酸突变为天冬氨酸，且第36位精氨酸突变为异亮氨酸； (3)野生型醇脱氢酶的氨基酸序列中第34位丙氨酸、缬氨酸、或半胱氨酸突变为异亮氨酸，且第35位丝氨酸突变为天冬氨酸，且第36位精氨酸突变为异亮氨酸； (4)野生型醇脱氢酶的氨基酸序列中第13位丝氨酸突变为丙氨酸，且第34位丙氨酸、缬氨酸、或半胱氨酸突变为异亮氨酸，且第35位丝氨酸突变为天冬氨酸，且第36位精氨酸突变为异亮氨酸； 其中，所述的野生型醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2、4、6或8中的任意一项所示。2.一种重组质粒，其特征在于，它是含有编码权利要求1所述的醇脱氢酶突变体的基因序列的质粒。3.根据权利要求2所述的重组质粒，其特征在于，所述的质粒为pET24a...

【专利技术属性】
技术研发人员：严明，许琳，邱晓鸾，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：