乙醇诊断／测定试剂（盒）及乙醇浓度测定方法技术

本发明专利技术涉及一种利用酶倍增法、酶比色法及酶联法技术的乙醇诊断／测定试剂（盒），同时本发明专利技术还涉及测定乙醇浓度的方法、试剂的组成及成分，属于医学／食品／环境检验测定技术领域。本发明专利技术的试剂（盒）主要成分包括：缓冲液、辅酶、甲酸、酒精脱氢酶、乳酸醛缩酶、乳酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外／可见光分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ处吸光度上升的程度，从而测算出乙醇的浓度大小。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种乙醇诊断/测定试剂(盒)，同时本专利技术还涉及测定乙醇浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定

技术介绍
乙醇具成瘾性，酒滥用和酒依赖是当今世界范围内最严重的社会经济和公共卫生问题之一。在西方国家，酒精相关性肝病已成为死亡的第六位原因。在我国，近20年来，随着社会经济发展，人均酒消耗量大幅度上升，酒依赖的患病率日趋增高。 生物样品中乙醇的定量测定方法主要有化学比色法，酶终点比色法，均相酶免疫测定法(EIA)，气相色谱法(GC)和呼出气乙醇分析。此外血清渗透量法可作乙醇半定量分析。 有多种化学比色法曾用于乙醇定量测定，微量扩散法是其中较简单实用的一种， 微量溢出的乙醇可使铬酸还原成蓝色的氧化铬。 根据所用的试剂酶不同，乙醇的酶法测定分为二种乙醇氧化酶法和乙醇脱氢酶 法，与乙醇氧化酶法相比，乙醇脱氢酶法的专一性高，不会与甲醇和丙酮起催化反应。 —般认为气相色谱法可作为参考方法，尤其在准确性和精密度要求高的法医学乙 醇测定中应用最广。GC法的独特优点在于特异、灵敏，且能同时分析多种挥发性醇类物质， 如乙醇、甲醇、丙酮、乙醛和异丙醇。 其他乙醇的测定方法还有均相酶免疫分析(Homogeneous enzymeimm皿oassay)、 渗透量法、呼出气乙醇分析法；用呼出气乙醇分析仪检测乙醇操作简单、快速，在交通执法 部门应用较多。这类仪器中一种是根据红外光吸收原理设计的，该法测定的乙醇浓度与酶 法测得的血乙醇浓度相关性很好。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提出 一 种利用酶倍增法(EnzymaticDoublingMethod)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(CoupleReaction)技术，计量还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定乙醇浓度的方法，同时，本专利技术还将给出用以实现该方法的乙醇诊断/测定试剂(盒)，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行乙醇浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。 本专利技术乙醇浓度测定方法如下 乙醇+辅酶酒精脱氡酶乙醛+还原型辅酶 乙醛+甲酸乳酸醛缩酶乳酸 乳酸+辅酶乳酸脱氡酶丙酮酸+还原型辅酶 这种方法应用酒精脱氢酶(alcohol dehydrogenase ;EC 1. 1. 1. 1)酶(偶)联乳 酸醛縮酶(lactate aldolase ;EC 4. 1. 2. 36)、乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase ;EC1. 1. 1. 27 ;EC 1. 1. 1. 28 ;EC 1. 1. 2. 3)酶促反应比色终点法。酒精脱氢酶酶解乙醇反应产 生乙醛，再通过(偶)联合乳酸醛縮酶、乳酸脱氢酶的作用，最终二次将辅酶(在340nm处 没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在 340nm处吸光度上升的程度，通过测量340nm处吸光度上升的程度，可以测算乙醇的浓度大 小。 实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本专利技术乙醇诊断/测定试剂(盒)较为理想 缓冲液 10Ommol/L 稳定剂 500mmol/L 辅酶 3mmol/L 甲酸 9mmol/L 酒精脱氢酶 10000U/L 乳酸醛縮酶 12000U/L 乳酸脱氢酶 12000U/L 本专利技术的乙醇诊断/测定试剂(盒)可以是单剂，包括 缓冲液、稳定剂、辅酶、甲酸、酒精脱氢酶、乳酸醛縮酶、乳酸脱氢酶。 试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂l缓冲液、稳定齐U、辅酶、甲酸。 试剂2缓冲液、稳定剂、酒精脱氢酶、乳酸醛縮酶、乳酸脱氢酶。辅酶、甲酸、酒精脱氢酶、乳酸醛縮酶、乳酸脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以 试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1 缓冲液、稳定齐U、辅酶、甲酸。 试剂2 缓冲液、稳定剂、乳酸醛縮酶、乳酸脱氢酶。 试剂3 缓冲液、稳定剂、酒精脱氢酶。 辅酶、甲酸、酒精脱氢酶、乳酸醛縮酶、乳酸脱氢酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位 置可以不限。试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试 剂，直接使用。 无论是单剂、双剂还是三剂，本专利技术测定乙醇浓度的方法，其辅酶可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一种。具体实施例方式下面结合实施例子对本专利技术作进一步的说明。 实施例一 本实施例的乙醇诊断/测定试剂为单试剂，包括 三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 10Ommol/L 稳定剂 500mmol/L 辅酶 3,1/L 甲酸 9mmol/L 酒精脱氢酶 10000U/L 乳酸醛縮酶 12000U/L 乳酸脱氢酶 12000U/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净 水，复溶后使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间10分钟，起始吸光度《0. l，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测乙醇样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。 加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度，从而测算出乙醇的浓度大小。 实施例二 本实施例的乙醇诊断/测定试剂为双试剂，包括 试剂1三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50mmol/L 辅酶 3mmol/L 甲酸 9mmol/L 试剂2三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50mmol/L 酒精脱氢酶 10000U/L 乳酸醛縮酶 12000U/L 乳酸脱氢酶 12000U/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37t:，反应时间10分钟，起始吸光度《0. l，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测乙醇样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。 加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度，从而测算出乙醇的浓度大小。 实施例三 本实施例的乙醇诊断/测定试剂为三试剂，包括 试剂l三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50mmol/L 辅酶 3mmol/L 甲酸 9mmol/L 试剂2三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 lOOmmol/L 稳定剂 500mmol/L 乳酸醛縮酶 12000U/L 乳酸脱氢酶 12000U/L 试剂3三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 lOOmmol/L 稳定剂 500mmol/L 酒精脱氢酶 10000U/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酶倍增法、酶比色法及酶联法的乙醇的浓度测定方法，其方法如下：乙醇＋辅酶酒精脱氢酶乙醛＋还原型辅酶乙醛＋甲酸乳酸醛缩酶乳酸乳酸＋辅酶乳酸脱氢酶丙酮酸＋还原型辅酶将最终反应物置于紫外／可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ吸光度上升的程度，测算出乙醇的浓度大小测定结果。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：苏州艾杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]