用于肽生产的融合伴侣制造技术

本发明专利技术涉及医药领域，特别地，涉及作为融合蛋白的部分的大量可溶性重组多肽的生产，所述融合蛋白包含连接于目标多肽的N‑末端融合伴侣。

A fusion partner for peptide production

The present invention relates to the field of medicine, in particular, relates to a soluble recombinant fusion protein as a part of the production of the fusion protein comprising the N terminal connected to the target peptide fusion partner.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于肽生产的融合伴侣
技术介绍
由于包括蛋白质水解、低表达水平、不正确的蛋白质折叠(其可能导致差的溶解性)以及宿主细胞的差的分泌的原因，异源重组多肽常常难以在细菌表达系统中高产量地表达。
技术实现思路
本专利技术提供了包含目标多肽的重组融合蛋白。目标多肽作为所述的重组融合蛋白的部分的表达允许大量地产生高品质多肽。目标多肽包括小的或快速降解的肽，例如，甲状旁腺激素N-末端片段(PTH1-34)，具有易于降解的N-末端的蛋白质，例如，GCSF和恶性疟原虫(P.falciparum)环子孢子蛋白，和通常以不溶形式在微生物表达系统中产生的蛋白质，例如，可以加工成胰岛素或胰岛素类似物的前胰岛素、GCSF或IFN-β。图1中图示的重组融合蛋白包含N-末端细菌融合伴侣，例如，细菌伴侣蛋白(chaperone)或折叠调节子。目标多肽和N-末端细菌伴侣蛋白或折叠调节子通过含有蛋白酶切割位点的柔性接头序列连接。切割时，目标多肽从N-末端融合伴侣释放。本专利技术进一步公开了用于表达重组融合蛋白的载体，以及用于在细菌宿主细胞中以高产率生产重组融合蛋白的方法。本专利技术的重组融合构建体对于生产高产量的重组目标多肽(其由于例如蛋白质水解、低表达水平、差的折叠和/或差的分泌而难以在细菌表达系统中超表达)是有用的。在本专利技术的实施方案中，本专利技术的重组融合蛋白以高于0.5g/L的滴定度在细菌宿主细胞中产生。在一些实施方案中，重组目标多肽难以在其中超表达的细菌宿主细胞是大肠杆菌。例如，PTH1-34蛋白，之前报道为作为包涵体(其需要高浓度的脲(例如，7M)来溶解)中的融合蛋白的部分表达，在本文中描述为作为可溶性PTH1-34融合蛋白的部分以高滴定度表达(高于0.5g/L)产生。此外，可以在非变性条件下进行纯化，例如，4M或更低浓度的脲，或完全不使用脲。此外，使用本专利技术的方法，具有容易降解的N-末端的蛋白质，例如，N-met-GCSF或恶性疟原虫环子孢子蛋白，可以作为所述的融合蛋白的部分产生并在从融合蛋白制备物中除去宿主细胞蛋白酶后，通过切割与N-末端融合伴侣分离。还如本文中描述的，通常以不溶形式产生的前胰岛素可以在本专利技术的重组融合蛋白中以可溶形式大量地生产，消除了对重折叠的需求。本专利技术因此提供了重组融合蛋白，其包含：N-末端融合伴侣，其中N-末端融合伴侣是细菌伴侣蛋白或折叠调节子；目标多肽；以及在N-末端融合伴侣和目标多肽之间的包含切割位点的接头。在一些实施方案中，N-末端融合伴侣选自：DnaJ-样蛋白；Fk1B蛋白或其截短体；EcpD蛋白或其截短体；或Skp蛋白或其截短体。在一些实施方案中，N-末端融合伴侣选自：荧光假单胞菌DnaJ-样蛋白；荧光假单胞菌Fk1B蛋白或其C-末端截短体；荧光假单胞菌FrnE蛋白或其截短体；荧光假单胞菌FkpB2蛋白或其C-末端截短体；或荧光假单胞菌EcpD蛋白或其C-末端截短体。在某些实施方案中，N-末端融合伴侣是荧光假单胞菌Fk1B蛋白，从C-末端除去1至200个氨基酸的截短体，荧光假单胞菌EcpD蛋白，从C-末端除去1至200个氨基酸的截短体，或荧光假单胞菌FrnE蛋白，从C-末端除去1至180个氨基酸的截短体。在一些实施方案中，目标多肽是选自以下的难表达的蛋白质：小的或快速降解的肽；具有容易降解的N-末端的蛋白质；和通常以不溶形式在细菌表达系统中表达的蛋白质。在一些实施方案中，目标多肽是小的或快速降解的肽，其中目标多肽选自：hPTH1-34、Glp1、Glp2、IGF-1艾塞那肽(Exenatide)(SEQIDNO:37)、替度鲁肽(Teduglutide)(SEQIDNO:38)、普兰林肽(Pramlintide)(SEQIDNO:39)、齐考诺肽(Ziconotide)(SEQIDNO:40)、贝卡普勒明(Becaplermin)(SEQIDNO:42)、恩夫韦肽(Enfuvirtide)(SEQIDNO:43)、奈西立肽(Nesiritide)(SEQIDNO:44)。在一些实施方案中，目标多肽是具有容易降解的N-末端的蛋白质，其中目标多肽是N-met-GCSF或恶性疟原虫环子孢子蛋白。在一些实施方案中，目标多肽是通常作为不溶蛋白在细菌表达系统中表达的蛋白质，其中目标多肽是可加工成胰岛素或胰岛素类似物的前胰岛素、GCSF或IFN-β。在这些实施方案中的任一个中，前胰岛素C-肽具有选自SEQIDNO:97；SEQIDNO:98；SEQIDNO:99或SEQIDNO:100的氨基酸序列。在一些实施方案中，胰岛素类似物是甘精胰岛素(insulinglargine)、门冬胰岛素(insulinaspart)、赖脯胰岛素(insulinlispro)、谷赖胰岛素(insulinglulisine)、地特胰岛素(insulindetemir)或德谷胰岛素(insulindegludec)。在某些实施方案中，N-末端融合伴侣是具有SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的荧光假单胞菌DnaJ-样蛋白。在一些实施方案中，N-末端融合伴侣是具有SEQIDNO:4、SEQIDNO:28、SEQIDNO:61或SEQIDNO:62中所示氨基酸序列的荧光假单胞菌Fk1B蛋白。在一些实施方案中，N-末端融合伴侣是具有SEQIDNO:3、SEQIDNO:63或SEQIDNO:64中所示氨基酸序列的荧光假单胞菌FrnE-样蛋白。在一些实施方案中，N-末端融合伴侣是具有SEQIDNO:7、SEQIDNO:65、SEQIDNO:66或SEQIDNO:67中所示的氨基酸序列的荧光假单胞菌EcpD蛋白。在一些实施方案中，重组融合蛋白中的切割位点被由以下组成的组中的裂解酶识别：肠激酶、胰蛋白酶、因子Xa和弗林蛋白酶。权利要求1至15任一项的重组融合蛋白，其中接头包含亲和性标签。在某些实施方案中，亲和性标签选自：聚组氨酸；FLAG标签；myc标签；GST标签；NBP标签；钙调蛋白标签；HA标签；E-标签；S-标签；SBP标签；Softtag3；V5标签；和VSV标签。在一些实施方案中，接头具有选自以下的氨基酸序列：SEQIDNO:9；SEQIDNO:10；SEQIDNO:11；SEQIDNO:12；和SEQIDNO:226。在一些实施方案中，目标多肽是hPTH1-34，并且重组融合蛋白包含选自以下的氨基酸序列：SEQIDNO:45；SEQIDNO:46；和SEQIDNO:47。在一些实施方案中，目标多肽的等电点比N-末端融合伴侣的等电点高至少约1.5倍。在一些实施方案中，目标多肽的分子量构成重组融合蛋白的分子量的约10％至约50％。本专利技术还提供了用于重组融合蛋白表达的表达载体。在一些实施方案中，表达载体是用于表达在上述任一个实施方案中的重组融合蛋白。在一些实施方案中，表达载体包含编码以上任一个实施方案的重组融合蛋白的核苷酸序列。本专利技术进一步提供用于生产目标多肽的方法，包括：(i)培养用包含表达构建体的表达载体转化的微生物宿主细胞，其中该表达构建体包含编码重组融合蛋白的核苷酸序列；(ii)诱导步骤(i)的宿主细胞以表达重组融合蛋白；(iii)纯化步骤(ii)的诱导宿主细胞中表达的重组融合蛋白；和(iv)通过用识别接头中的切割位点的裂解酶孵育来切割步本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组融合蛋白，其包含：N‑末端融合伴侣，其中所述N‑末端融合伴侣是细菌伴侣蛋白或折叠调节子；目标多肽；以及在所述N‑末端融合伴侣和所述目标多肽之间的包含切割位点的接头。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.01 US 62/086,1191.一种重组融合蛋白，其包含：N-末端融合伴侣，其中所述N-末端融合伴侣是细菌伴侣蛋白或折叠调节子；目标多肽；以及在所述N-末端融合伴侣和所述目标多肽之间的包含切割位点的接头。2.权利要求1的重组融合蛋白，其中所述N-末端融合伴侣选自：DnaJ-样蛋白；Fk1B蛋白或其截短体；FrnE蛋白或其截短体；FkpB2蛋白或其截短体；EcpD蛋白或其截短体；或Skp蛋白或其截短体。3.权利要求1的重组融合蛋白，其中所述N-末端融合伴侣选自：荧光假单胞菌DnaJ-样蛋白；荧光假单胞菌Fk1B蛋白或其C-末端截短体；荧光假单胞菌FrnE蛋白或其截短体；荧光假单胞菌FkpB2蛋白或其C-末端截短体；或者荧光假单胞菌EcpD蛋白或其C-末端截短体。4.权利要求3的重组融合蛋白，其中所述N-末端融合伴侣是荧光假单胞菌Fk1B蛋白，从C-末端除去1至200个氨基酸的截短体；荧光假单胞菌EcpD蛋白，从C-末端除去1至200个氨基酸的截短体；或荧光假单胞菌FrnE蛋白，从C-末端除去1至180个氨基酸的截短体。5.权利要求1至4任一项的重组融合蛋白，其中所述目标多肽是难以表达的蛋白质，选自：小的或快速降解的肽；具有易降解N-末端的蛋白质；和通常以不溶形式在细菌表达系统中表达的蛋白质。6.权利要求1至5任一项的重组融合蛋白，其中所述目标多肽是小的或快速降解的肽，其中所述目标多肽选自：hPTH1-34、Glp1、Glp2、IGF-1艾塞那肽(SEQIDNO:37)、替度鲁肽(SEQIDNO:38)、普兰林肽(SEQIDNO:39)、齐考诺肽(SEQIDNO:40)、贝卡普勒明(SEQIDNO:42)、恩夫韦肽(SEQIDNO:43)、奈西立肽(SEQIDNO:44)。7.权利要求1至5任一项的重组融合蛋白，其中所述目标多肽是具有易降解N-末端的蛋白质，其中所述目标多肽是N-met-GCSF或恶性疟原虫环子孢子蛋白。8.权利要求1至5任一项的重组融合蛋白，其中所述目标多肽是通常以不溶形式在细菌表达系统中表达的蛋白质，其中所述目标多肽是可加工成胰岛素或胰岛素类似物的前胰岛素、N-met-GCSF、GCSF或IFN-β。9.权利要求7的重组融合蛋白，其中C-肽具有选自SEQIDNO:97；SEQIDNO:98；SEQIDNO:99或SEQIDNO:100的氨基酸序列。10.权利要求7或7任一项的重组融合蛋白，其中所述胰岛素类似物是甘精胰岛素、门冬胰岛素、赖脯胰岛素、谷赖胰岛素、地特胰岛素...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·M·雷塔拉克，A·查普曼，T·R·布鲁克，H·金，
申请(专利权)人：菲尼克斯公司，
类型：发明
国别省市：美国,US