一种发酵生产杆菌肽的方法技术

本发明专利技术属于发酵工程领域，具体涉及一种提高微生物发酵生产杆菌肽产量的方法。该方法通过1）优化有机复合氮源和发酵条件，保证了批次间发酵单位的稳定性，降低了杂质F含量；2）在杆菌肽合成期间添加超顺磁性微球，降低发酵产物对产生菌的反馈抑制。发酵结束后，杆菌肽的发酵单位可达1228U/ml，比优化前可使杆菌肽产量提高123%，提高了产能，降低了能耗及废弃物的排放。

Method for producing Bacillus peptide by fermentation

The invention belongs to the field of fermentation engineering, in particular to a method for improving the production of Bacillus peptide by microorganism fermentation. By this method, 1) composite organic nitrogen source and optimization of fermentation conditions, to ensure the stability of batch fermentation unit, reduce the impurity content of F; 2) adding superparamagnetic microspheres during bacitracin synthesis, reduce fermentation product feedback inhibition of producing bacteria. At the end of fermentation, the fermentation unit of Bacillus peptide could reach 1228U/ml, which could increase the production of Bacillus peptide by 123%, and increase the capacity and reduce the energy consumption and waste emissions.

【技术实现步骤摘要】
一种发酵生产杆菌肽的方法
本专利技术属于发酵工程领域，具体涉及一种发酵生产杆菌肽的方法。
技术介绍
杆菌肽是一种由12种氨基酸组成的噻唑肽类窄谱抗生素，主要由特雷斯氏枯草杆菌和地衣芽孢杆菌发酵产生，对革兰氏阳性球菌和杆菌有效，对少数革兰氏阴性菌、螺旋体及放线菌也有一定的抑制作用。杆菌肽具有高效、低毒、残留量少等优点。因此，杆菌肽不仅是一种重要的抗生素药物，也是安全性良好的畜禽抗生素饲料添加剂。杆菌肽是几种相似多肽组分的混合物，含有杆菌肽A、B1、B2、B3、C1、C2、C3、E、F等化学结构类似的异构体，其主要活性成分为杆菌肽A，分子式为C66H103N17O16S。杆菌肽F是杆菌肽A的降解产物，有肾毒性，需严格控制其含量。杆菌肽是类白色至淡黄色的粉末，无嗅、味苦，有吸湿性，易被氧化剂破坏，在溶液中能被多种重金属盐类沉淀，杆菌肽在水中易溶，在乙醇中溶解，在丙酮、三氯甲烷或乙醚中不溶。在现有技术中，杆菌肽发酵具有其自身的特点，在大规模生产中也面临着一些需要解决的难题。1）杆菌肽最终效价、杂质F的含量受发酵过程中温度影响很大。随着发酵温度的升高，杆菌肽效价增加，但同时杂质F的比例大幅度的增加。例如常规的杆菌肽发酵过程中，当发酵温度是37℃时杂质F的比例高达10%。2）杆菌肽为微生物发酵的次级代谢产物，存在于发酵液中。杆菌肽不仅对其他生物有杀死或抑制作用，对产生菌自身也有杀死或抑制作用。随着杆菌肽在发酵液中浓度不断增高，其产生菌受到高浓度产物的反馈调节作用，使产生菌生物细胞及酶的潜力不能充分发挥，造成杆菌肽的产率难以提高，从而成为制约提高杆菌肽发酵水平的瓶颈。选育能耐受高浓度杆菌肽的产生菌固然可以使生产指标得以提高，但并不能从根本上解决问题。添加大孔吸附树脂也可降低发酵产物对产生菌的反馈抑制，使杆菌肽产量提高11%以上，但大孔树脂的加入导致菌丝过早断裂并衰亡，存在发酵终点明显提前的弊端，加入的大孔树脂和菌丝混在一起，无法有效分离。3）杆菌肽是肽类抗生素，由一系列氨基酸通过酶催化合成，因而氮代谢对杆菌肽的合成影响明显。而目前的有机氮源大多为大宗农副产品，其质量受产地、加工方式等影响，造成大规模生成中不同发酵批次间菌种的次级代谢水平不一致，进而影响下游纯化，最终影响产品质量。酵母粉和棉籽蛋白粉，是近年发展起来的有机氮源。其中棉籽蛋白粉是一种以特定地区的优质棉籽为原料，采用先进的技术生产的高蛋白、低酚、低纤维、微生物利用效果好的有机氮源，产品的蛋白含量在50%以上，氨基酸组成占总氮的90%以上，游离棉酚的含量控制在600ppm以下，产品质量稳定。酵母粉为标准化有机氮源，蛋白质含量高（蛋白质占干菌体总重50%以上），含有18种氨基酸，种类齐全，维生素和矿物质等含量丰富。但未见有报道将两种有机氮源配合应用于地衣芽孢杆菌生物合成杆菌肽。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决现有技术中微生物发酵制备杆菌肽存在的发酵过程不稳定及发酵水平低的问题，提供一种通过优化发酵培养基配方（特别是氮源类型）、发酵条件（如发酵温度），在发酵过程的特定时间段中添加超顺磁性微球，减少反馈抑制，来提高杆菌肽产量的方法。本专利技术的关键构思为：采用地衣芽孢杆菌菌株为出发菌株，在微生物发酵生产杆菌肽过程中，优化初始pH值、发酵温度及时间、接种量等条件，优化复合有机氮源，在杆菌肽合成期间添加超顺磁性微球，提高杆菌肽的产量。本专利技术所提供的一种发酵生产杆菌肽的方法，包括以下步骤：a、制备地衣芽孢杆菌菌株的种子液将地衣芽孢杆菌菌株的斜面培养物接种于种子培养基，28-30℃、200-240rpm，培养20-28h获得种子液；其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉3.0-5.0克、葡萄糖10.0-20.0克、酵母粉10.0-20.0克、硫酸铵1.0-2.0克、氯化钠1.0-2.0克、七水硫酸镁1.0-1.5克，加水定容至1000mL，pH6.5-7.0，121℃灭菌30min。本专利技术所述杆菌肽产生菌可选用菌株ATCC10716。b、制备地衣芽孢杆菌菌株的发酵液将上述种子液以体积百分比6-10%的接种量接种于发酵培养基，在摇瓶或发酵罐中发酵，发酵15-25小时之间添加经过灭菌后的超顺磁性微球，继续发酵，总发酵时间72-96h，发酵温度28-30℃，得到发酵液；其中所述发酵培养基按以下方法制得：玉米淀粉30.0-40.0克、葡萄糖10.0-20.0克、棉籽蛋白粉15.0-30.0克、酵母粉10.0-20.0克、硫酸铵2.0-3.0克、玉米浆3.0-5.0克、磷酸二氢钾1.0-1.5克、氯化钠2.0-3.0克、七水硫酸镁1.0-2.0克，加水定容至1000mL，pH6.5-7.0，121℃灭菌30min。其中步骤b中所述有机氮源中棉籽蛋白粉和酵母粉比例为3:1至1:1。本专利技术的进一步改进在于：其中步骤b中有机氮源中棉籽蛋白粉和酵母粉添加比例为3:2。本专利技术的进一步改进在于：发酵罐压力为0.05±0.01Mpa、搅拌速度为300-400rpm，通气比为1:0.8-1.2vvm。本专利技术所述超顺磁性微球是一种内核含磁性的Fe3O4，外层包被多孔的高分子聚合物的微球。本专利技术中MagneStar®MP-02系列磁珠，商购于苏州纳微科技有限公司，该微球的内核具有超顺磁性，饱和磁化强度为30-40emu/g；微球的粒径为10-30μm，粒径分布为单分散；高分子聚合物层呈现多孔性质，孔径为20-30nm,该多孔聚合物表面键合了羧基基团，羧基含量为200μmol/g；所述超顺磁性微球比表面积为150-240m2/g;所述超顺磁性微球为经过盐酸处理后的酸式结构。所述超顺磁性微球由于表面具有羧基基团，能够与含有氨基等碱性基团的物质键合，因此对发酵液中带有碱性基团的物质，包括杆菌肽各组分，具有一定的吸附能力。本专利技术的进一步改进在于：超顺磁性微球的添加量为1.0-2.0%（w/v），即每升发酵液添加10-20g。本专利技术的有益效果:上述优选条件，所获得杆菌肽的产量从550U/ml提高到1228U/ml，为杆菌肽的工业化生产提供了一种方法。本专利技术中通过优化配方和发酵条件，选择特定的优质氮源：酵母粉、棉籽蛋白粉按一定比例的混合物，以及降低发酵温度为30℃，提高了杆菌肽产量，杂质F的含量控制在2%以下，也保证了批次间发酵单位的稳定性。在发酵过程的特定时间段，通过在发酵液中添加超顺磁性微球，可以非特异性的吸附发酵液中一些成分，所述成分包括发酵液中的杆菌肽、杂质F，在一定程度上降低发酵过程中发酵液内杆菌肽含量，因此也适当降低了发酵产物杆菌肽对产生菌的反馈抑制。方法优化后可使杆菌肽产量提高36%以上；提高了产能，降低了能耗及废弃物的排放。如果应用大孔树脂法，在发酵液中加入大量的大孔树脂，我们发现大量大孔树脂的加入导致菌丝过早断裂并衰亡，发酵终点明显提前，导致最终产量提高有限。超顺磁性微球法与大孔树脂法相比，克服了上述弊端，发酵后的杆菌肽产量提高了19%。超顺磁性微球法还克服了加入到发酵液中的大孔吸附树脂无法回收，导致环境污染的缺点，超顺磁性微球用外加磁场易于回收，再生后可重复使用，工艺过程绿色环保。附图说明图1为菌株发酵培养15小时的菌体形态。图2为菌株发酵培养25小时的菌体形态。具体实施方式下面结合本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种发酵生产杆菌肽的方法，包括以下步骤：a、制备地衣芽孢杆菌菌株的种子液将地衣芽孢杆菌菌株的斜面培养物接种于种子培养基，28‑30℃、200‑240 rpm，培养20‑28 h获得种子液；其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉3.0‑5.0克、葡萄糖10.0‑20.0克、酵母粉10.0‑20.0克、硫酸铵1.0‑2.0克、氯化钠1.0‑2.0克、七水硫酸镁1.0‑1.5克，加水定容至1000mL，pH6.5‑7.0，121℃灭菌30min；b、制备地衣芽孢杆菌菌株的发酵液将上述种子液以体积百分比6‑10%的接种量接种于发酵培养基，在摇瓶或发酵罐中发酵，发酵时间72‑96 h，发酵温度28 ‑30 ℃，得到发酵液；其中所述发酵培养基按以下方法制得：玉米淀粉30.0‑40.0克、葡萄糖10.0‑20.0克、棉籽蛋白粉15.0‑30.0克、酵母粉10.0‑20.0克、硫酸铵2.0‑3.0克、玉米浆3.0‑5.0克、磷酸二氢钾1.0‑1.5克、氯化钠2.0‑3.0克、七水硫酸镁1.0‑2.0克，加水定容至1000mL，pH6.5‑7.0，121℃灭菌30min。

【技术特征摘要】
2016.02.23 CN 20161009798341.一种发酵生产杆菌肽的方法，包括以下步骤：a、制备地衣芽孢杆菌菌株的种子液将地衣芽孢杆菌菌株的斜面培养物接种于种子培养基，28-30℃、200-240rpm，培养20-28h获得种子液；其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉3.0-5.0克、葡萄糖10.0-20.0克、酵母粉10.0-20.0克、硫酸铵1.0-2.0克、氯化钠1.0-2.0克、七水硫酸镁1.0-1.5克，加水定容至1000mL，pH6.5-7.0，121℃灭菌30min；b、制备地衣芽孢杆菌菌株的发酵液将上述种子液以体积百分比6-10%的接种量接种于发酵培养基，在摇瓶或发酵罐中发酵，发酵时间72-96h，发酵温度28-30℃，得到发酵液；其中所述发酵培养基按以下方法制得：玉米淀粉30.0-40.0克、葡萄糖10.0-20.0克、棉籽蛋白粉15.0-30.0克、...

【专利技术属性】
技术研发人员：任风芝，张雪霞，王耀耀，耿文飞，郑智慧，杨海静，高任龙，段宝玲，张炜，
申请(专利权)人：华北制药集团新药研究开发有限责任公司，
类型：发明
国别省市：河北,13