本发明专利技术属于医学和生物工程技术领域，本发明专利技术提供了一种重组蛋白rPmt4p及其表达，以及该重组蛋白rPmt4p在制备防治侵袭性白念珠菌感染疫苗中的应用。进一步地，本发明专利技术提供了一种预防或治疗侵袭性白念珠菌感染的蛋白疫苗，该蛋白疫苗的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明专利技术的蛋白疫苗在动物模型中显著增加感染小鼠的生存率，并诱导持久的体液及细胞应答。本发明专利技术方法简单，生产成本低廉，易于推广。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医学和生物工程
，具体涉及一种重组蛋白rPmt4p及其表达与在制备防治侵袭性白念珠菌感染疫苗中的应用。
技术介绍
随着抗肿瘤放化疗、介入治疗、器官移植术后免疫抑制剂的广泛应用，尤其是艾滋病的流行，免疫功能低下或缺陷的病人数量不断增加，侵袭性真菌感染已逐渐成为一种常见病、多发病，并已成为免疫功能低下人群死亡的主要原因。念珠菌是机会性致病真菌中的主要一属，其中白念珠菌(Candida albicans)的毒力最强，感染率最高，引起严重的侵袭性念珠菌病(invasive candidiasis，IC)，死亡率高达40％。我国2013年最新统计数据表明，白念珠菌是侵袭性念珠菌血症的主要病原菌，占57％左右。Pmt4p是白念珠菌细胞壁上的甘露糖蛋白(Protein mannosyltransferase)，Prill SK等人研究发现，在小鼠尾静脉注射5×105PMT4基因缺失菌后与野生型对照组相比存活率是100％，证明了PMT4是与念珠菌菌丝生长及毒力有显著性关系的基因(Prill SK,et al.(2005)PMT family of Candida albicans:five protein mannosyltransferase isoforms affect growth,morphogenesis and antifungal resistance.Mol Microbiol 55(2):546-60)。目前尚无文献报道用生物工程方法制备重组Pmt4p蛋白，也尚无文献报道Pmt4p蛋白用于预防或治疗侵袭性念珠菌感染的研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种白念珠菌细胞壁上的甘露糖重组蛋白rPmt4p，本专利技术的另一目的在于提供该重组蛋白rPmt4p的表达，以及该重组蛋白rPmt4p在制备防治侵袭性白念珠菌感染疫苗中的应用。本专利技术人研究发现，白念珠菌SC5314的细胞壁上的甘露糖蛋白Pmt4p(GENBANK NO：3644096)的301至520氨基酸序列，可用于制备一种治疗侵袭性念珠菌感染的蛋白疫苗。本专利技术的第一方面，是提供一种重组蛋白rPmt4p，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本专利技术的第二方面，是提供上述的重组蛋白rPmt4p在制备预防或治疗侵袭性白念珠菌感染疫苗中的应用。本专利技术的第三方面，是提供一种预防或治疗侵袭性白念珠菌感染的蛋白疫苗，该蛋白疫苗的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。该蛋白疫苗是通过以下方法制备得到的：A、克隆如SEQ ID NO:2所示的DNA序列；B、构建含有如SEQ ID NO:2所示的DNA序列的重组质粒；C、在真核表达系统酿酒酵母INVSc1中表达如SEQ ID NO:1所示的重组蛋白(rPmt4p)。步骤A中，克隆DNA序列，以白念珠菌SC5314基因组DNA为模板，引物PMT4-Exp-F如SEQ ID NO:3所示，引物PMT4-Exp-R如SEQ ID NO:4所示。步骤B中，构建重组质粒所用的质粒载体为PYES2/CT质粒。本专利技术的具体技术方案如下：1、Pmt4p蛋白表达基因的克隆以白念珠菌SC5314基因组DNA为模板，引物PMT4-Exp-F：GCggatccATGTCTAGATCTGGCCCAGGTGATGC(SEQ ID NO:3)及PMT4-Exp-R：ATTTgcggccgcGAAATTCCAAATATTGTCC(SEQ ID NO:4)扩增，PCR扩增产物片段长度为660bp(SEQ ID NO:2)；2、重组真核表达质粒的构建将上述获得的重组Pmt4p基因片段插入到PYES2/CT质粒中，构建PYES2/CT-PMT4重组质粒，将上述重组质粒转化感受态细胞DH-5α，重组质粒酶切鉴定正确后送测序，序列如SEQ ID NO:2所示，重组片段序列与Pmt4p蛋白301至520氨基酸序列完全一致。3、阳性重组质粒DNA的转染将酶切和测序结果都为阳性的重组质粒转染到表达菌株酿酒酵母INVSc1中。4、菌落PCR鉴定阳性转染克隆挑取转染后在SC-ura-的固体平板上长出的单克隆，每个平板上挑取10个单克隆，每个克隆加入35μl Zymolyase混匀，37℃孵育60min；孵育后的产物2μl作为模板用相应的4对引物进行PCR扩增；挑取没有转染重组质粒DNA的INVSc1单克隆作为阴性对照。5、基因组PCR鉴定阳性转染克隆菌落PCR鉴定为阳性的单克隆在SC-ura-的液体培养基中，30℃培养过夜；提取基因组；用相应的4对引物进行基因组PCR扩增，并用琼脂糖凝胶电泳验证。6、目的重组蛋白的诱导表达将菌落PCR和基因组PCR都鉴定为阳性的克隆在SC-ura-的液体培养基中，30℃振荡培养过夜，调节菌液OD600＝0.4，在1500g，4℃条件下，离心5min，弃上清，加入50ml的诱导培养基重新混匀，30℃振荡培养；分别在不同的时间点测定OD600的值；1500g，4℃，离心5min，弃上清；用1ml灭菌双蒸水洗3次，-80℃保存备用。7、目的重组蛋白的提取收集诱导培养基培养的菌液，1500g，4℃，离心5min，弃上清；用灭菌双蒸水洗3次，用裂解液重悬细胞，1500g，4℃，离心5min，弃上清；再加裂解液调整菌液的OD600＝1；加入等体积的直径为0.4mm的酸洗玻璃珠，在细胞涡旋匀浆器上涡旋破碎细胞30s，然后在冰水中停30s，重复6-8次，直至细胞大部分被裂解；吸出裂解后的菌液，高速离心15000g，4℃，离心10min，取上清到新的EP管中，-80℃保存备用。8、BCA法测定蛋白浓度使用BCA检测试剂盒测蛋白浓度。9、最佳诱导时间的考察提取用半乳糖诱导后不同时间点收集的菌液蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，确定最佳诱导时间10、目的蛋白的纯化使用Ni螯合的树脂和6×His标签蛋白结合的亲和层析纯化出分子量为30kD的目的蛋白。11、Western blot检测表达的目的蛋白使用10％聚丙烯酰胺凝胶凝胶电泳，蛋白上样量为20-30μg，电泳结束后用半干法将蛋白转移到NC膜上，加封闭液室温2h；PBST洗液洗膜5次，每次5min；用Anti-V5的以1:5000稀释后，4℃孵育过夜；孵育结束后用PBST洗液洗膜5次，每次5min；加二抗DYLightTM800-Labeled Antibody本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组蛋白rPmt4p，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
【技术特征摘要】
1.一种重组蛋白rPmt4p，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种如权利要求1所述的重组蛋白rPmt4p在制备预防或治疗侵袭性白念珠
菌感染疫苗中的应用。
3.一种预防或治疗侵袭性白念珠菌感染的蛋白疫苗，其特征在于，该蛋白疫苗
的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
4.一种如权利要求3所述的预防或治疗侵袭性白念珠菌感染的蛋白疫苗的制备
方法，包括以下步骤：
A、克隆如SEQ ID NO:2所示的DNA序列；
B、构建含有如SEQ ID NO:2所示的DNA序列的重组质粒；
C、在真核表达系统酿酒酵母INVSc1中表达如SEQ ID NO:1所示的重组蛋
白。
5.根据权利要求4所述的预防或治疗侵袭性白念珠菌感染的蛋白疫苗的制备方
法，其特征在于，步骤A中，克隆以白念珠菌SC5314基因组DNA为模板，设
计并合成引...
【专利技术属性】
技术研发人员：阎澜，王丽，王晓娟，姜远英，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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