一种肿瘤细胞靶向性穿膜肽制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及一种肿瘤细胞靶向性穿膜肽、多核苷酸分子、用途以及含其的靶向给药系统。本发明专利技术公开了一种肿瘤细胞靶向性穿膜肽，其特征在于其含有具有细胞穿膜肽活性的CPPs结构域和具有对肿瘤细胞特异性靶向亲和的EGF第三环样人工模拟肽结构域。本发明专利技术所述肿瘤细胞靶向性穿膜肽表现出了显著的穿膜作用效果，同时具有细胞特异性和种属特异性两种新型特性，可用于肿瘤疾病的诊断、治疗过程中所需药物的开发应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及一种肿瘤细胞靶向性穿膜肽、多核苷酸分子、用途以及含其的靶向给药系统。
技术介绍
细胞膜由脂质双分子层组成，其内部由疏水性的非极性分子构成。细胞膜是物质进出细胞的一道屏障，许多生物大分子如多肽、蛋白质、DNA是不能自由跨越细胞膜进行物质和信息传递的。这一屏障虽然对机体有保护作用，但也使许多有应用前景的药物被摒弃。近年来，国外学者在对一些病毒转染特性的研究中相继发现了一类蛋白结构域，如：人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV-1)的反式转录激活因子(TAT)、果蝇艇角同源异形域(ANTP)、单纯疱疹病毒I型VP22转录因子，不仅具有细胞穿透能力，而且具有介导异源蛋白、寡聚核苷酸、脂质体等大分子直接透过细胞膜进入细胞的功能，将其命名为细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides，CPPs)细，也被称之为蛋白转导域(protein transduction domain，PTD)，细胞穿膜肽(cell penetrating peptides,CPPs)又称为蛋白转导域或膜转导肽,是一种由30个或者更少氨基酸组成的能够穿透细胞膜的多肽,能够运载包括药物在内的许多物质，共有的性质:1)具有净正电荷性和两亲性;2)穿膜转运效率高;3)可以导入近乎所有的细胞;4)可以携带多种活性物质进入细胞;5)可以通过固相合成或原核表达制备,方法成熟简便。大量研究表明,CPPs具有强大的运载潜能,CPPs携带的物质可以为蛋白质(绿色荧光蛋白、RNA酶、半乳糖苷酶等)、多肽(100个氨基酸残基以下)、DNA、化学小分子药物、寡核苷酸(100bp以下)、反义核酸、肽核酸、纳米颗粒、荧光素、有机分子、腺病毒载体、成像物质、脂质体及铁颗粒等，运载能力可以达到120kDa(如半乳糖苷酶)、40nm(如铁颗粒),没有明显的证据表明运载极限。CPPs可以通过化学结合或基因融合等方式携带各种生物大分子。CPPs与药物的连接方式有两种:非共价连接和共价连接。但CPPs这种非特异性地穿膜特征虽然体现了CPPs在体内应用上的广泛性，但在实际应用过程中也将导致生物活性药物给药量的加大，药物治疗效率的降低，不良反应增加的忧虑。因此，对CPPs穿膜转运方式的改进不仅在临床应用上具有非常广阔的应用前景，而且也具有巨大的经济价值。大量研究证实，在大多数常见的肿瘤细胞表面都有表皮生长因子受体（EGFR）过度表达或者突变。EGFR异常高表达的肿瘤包括乳腺癌、肺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肾癌、神经胶质瘤、鼻咽癌、头颈部鳞状细胞癌等（Salomon等，Crit Rev Oncol Hematol.1995，19:183）。肿瘤细胞表面EGFR的过度表达以及肿瘤细胞的生长依赖于生长因子的特点使得EGFR成为了目前肿瘤专一性治疗研究的一大热点。EGFR被作为识别肿瘤细胞的专一性导向靶标，大量用于肿瘤专一性治疗药物的开发与研究（Seshacharyulu等，Expert Opin Ther Targets.2012，16:15）。但由于正常人体细胞表面也存在有EGFR，这些EGFR是正常细胞发挥其日常生理功能所必需。因此，虽然EGFR是一个非常适宜的肿瘤专一性治疗靶向物，但在利用其进行肿瘤治疗靶向药物的开发过程中，如何尽量避免其对正常细胞的影响，减少药物不良反应的发生，稳定发挥和提高药物的疗效是广大药物开发研究人员必须考虑和面对的问题。研究发现，在自然界人体中，EGFR除了与动物本人自身分泌的EGF等生长因子能与其EGFR专一性结合发挥作用外，人体分泌的许多其它生长因子，甚至包括一些由病毒分泌的生长因子由于其空间结构的某一部分与动物来源的生长因子类似，也能与EGFR进行不同程度的结合，诱导相应的生物学效应。这些生长因子包括人转化生长因子-α(hTGF-α)，人表皮调节素(hEPR)，人β细胞素（hBTC），二性调节素（Amphiregulin），肝素结合EGF样生长因子（HB-EGF），Heregulin，Betacelluin等等。病毒来源的有如痘苗病毒生长因子(VGF)，Shope纤维瘤病毒生长因子(SVGF)，粘液瘤病毒生长因子（MVGF)等。通过对此类生长因子的序列比对研究发现，能与EGFR结合的EGF类多肽具有类似的结构和功能，分子内都有6个Cys残基，可形成3个二硫键，并将50-90个左右的氨基酸肽链折叠成三环结构（见图1A，引自Cell,Vol.110,775–787,September20,2002），并共同具有丝裂原功能，在TGF-β存在的条件下可引起细胞转化，在软琼脂锚着实验中可形成细胞集落，这类TGF-α和病毒生长因子多肽被称之为EGF样多肽。后续研究表明，EGF样多肽中三环结构是其生物活性所必须的。以EGF为例，A环的R41残基在Site2处，B环的K28、C31、N32、C33残基在Site1处，C环的Q43、R45、L47残基在Site3处分别与EGFR上Domain I与Domain III部位的3个不同部位专一性结合（见图1B，引自Cell,Vol.110,775–787,September20,2002）。在这其中，EGF的第三环（C环）上的氨基酸残基更是插入到EGFR结合位点的深处发挥作用（Ogiso等，Cell，2002，110:775）。EGF和EGF样多肽在一级结构某些固定部位的氨基酸残基是非常保守的，为维持其生物活性所必需，它们起到维持空间构象和提供氢键和非极性疏水结合的作用。这些保守氨基酸任何缺失或大段缺失突变，都会导致这些生长因子与其受体结合活性的降低或完全丧失，从而影响其生物学功能。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题为提供一种肿瘤细胞靶向性穿膜肽，以提高治疗药物的药理作用效果，尽量减少对正常细胞的影响，减轻药物不良反应的发生。为此，本专利技术一方面公开了一种新型肿瘤细胞靶向性穿膜肽，其特征在于其含有具有细胞穿膜肽活性的CPPs结构域和EGF第三环样人工模拟肽结构域。本专利技术的专利技术思路为将EGF第三环样模拟肽氨基酸残基序列与细胞穿膜肽序列融合构成一种新型靶向型细胞穿膜肽，通过EGF第三环样模拟肽结构域能与肿瘤细胞表面表达丰富的EGFR专一性结合的特性，实现新型细胞穿膜肽在体内运输的肿瘤靶向性，从而发挥穿膜肽的专一性靶向转运作用，将药物分子在体内进行专一性的靶向投送传递进入肿瘤细胞，达到控制肿瘤细胞生长，减少对正常细胞的不良影响的治疗疾病的目的。本专利技术通过对E本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肿瘤细胞靶向性穿膜肽，其特征在于其含有具有细胞穿膜肽活性的CPPs结构域和具有对肿瘤细胞特异性靶向亲和的EGF第三环样人工模拟肽结构域。

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤细胞靶向性穿膜肽，其特征在于其含有具有细胞穿膜肽活性的CPPs结构域
和具有对肿瘤细胞特异性靶向亲和的EGF第三环样人工模拟肽结构域。
2.如权利要求1所述的肿瘤细胞靶向性穿膜肽，其特征在于所述肿瘤细胞靶向穿膜肽具有
下式：R1-L-R2或R2-L-R1，其中L是卷曲型连接肽；
R1为EGF第三环样人工模拟肽结构域，其氨基酸序列如Xaa1C Xaa3Xaa4Xaa5Y Xaa7Xaa8Xaa9RC Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15L
Xaa1：R、V、I、N、G、K、L中之一；
Xaa3：S、H、R、D、E、Q、V、G中之一；
Xaa4：H、I、S、E、K、Q、P、V、N中之一；
Xaa5：G、N、V、A、L、I中之一；
Xaa7：T、V、F、I、H、S、D中之一；
Xaa8：G、S、A中之一；
Xaa9：I、S、A、V、E、D中之一；
Xaa12：Q、E、T、H、K中之一；
Xaa13：H、T、Y、R、E、G、A、L中之一；
Xaa14：V、F、R、A中之一；
Xaa15：D、F、V、S中之一；
R2为具有细胞穿膜肽活性的CPPs结构域。
3.如权利要求1或2中所述的肿瘤细胞靶向性穿膜肽，其特征在于所述R1氨基酸序列
如SEQ ID NO.1-20所示。
4.如权利要求1或2中所述的肿瘤细胞靶向性穿膜肽，其特征在于所述CPPs结构域为人
免疫缺陷病毒转录激活因子TAT，单纯疱疹病毒I型VP22转录因子，果...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵健，王富军，傅云龙，张涛铸，单含文，任伟扬，谢先文，
申请(专利权)人：浙江日升昌药业有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33