高穿透性肿瘤靶向脂质插件的构建及其促进细胞及细胞膜制剂向肿瘤聚集的作用制造技术

本发明专利技术涉及实现高穿透性肿瘤靶向脂质插件及其制备方法，该插件由含有高穿透肽iRGD的成分以及DSPE‑PEG‑MAL构成，可嵌插在多种载药体系、细胞上，实现其主动肿瘤靶向性。本发明专利技术将含有穿透肽iRGD成分的物质作为实现肿瘤主动靶向性、高穿透性的分子，将其修饰一段脂质分子，形成一个能够明确增强肿瘤靶向性的多用肿瘤靶向插件。成功构建后经反复实验验证，本发明专利技术具有明确肿瘤靶向性，能够切实地增强细胞、细胞膜制剂等的肿瘤局部聚集，提高抗肿瘤治疗效果。

Construction of highly penetrating tumor targeting lipid receptor and its role in promoting cell and cell membrane preparation to tumor aggregation

The present invention relates to the high penetration of tumor targeted lipid plug and a preparation method thereof, the plug-in containing high penetrating peptide iRGD DSPE PEG MAL composition and structure, can be inserted in a variety of cells, drug delivery system, implement its active tumor targeting. The present invention contains penetrating peptide iRGD substance as tumor targeting, high penetration of molecules, the modification of a lipid molecule could form a clear enhancement of tumor targeting with tumor targeting plugin. After successfully constructed and proved by repeated experiments, the invention has definite tumor targeting property, can effectively enhance the local aggregation of the cells, the cell membrane preparations, etc., and improves the anti-tumor therapeutic effect.

【技术实现步骤摘要】
高穿透性肿瘤靶向脂质插件的构建及其促进细胞及细胞膜制剂向肿瘤聚集的作用
本专利技术属于生物与新医药
，特别涉及高穿透性肿瘤靶向生物膜载药体系、主动靶向性高穿透性细胞的制备及其在抗肿瘤中的应用。
技术介绍
本专利技术之前，包括传统化疗药物、抗肿瘤药物纳米制剂在内的多种抗肿瘤药物多缺乏主动的肿瘤靶向性，治疗效果差强人意。这些药物进入人体后的分布多无组织特异性，且由于复杂的肿瘤微环境，药物无法渗透至肿瘤病灶深部，影响其抗肿瘤效果。至目前，经过研究者们的不断努力，也有不同类型的主动肿瘤靶向纳米载体被研发出来，但这些技术大多限于实验研究。近十年来，肿瘤纳米靶向药物载体领域发展迅速，制备载体的材料经历了一个由天然高分子材料到人工合成智能化材料再到天然材料的转变过程。然而这些FDA批准的材料仍然是异体物质，我们迫切地想寻找到一种以人体自身物质为材料构建的纳米药物载体。在越来越引起人们重视的免疫细胞治疗领域，尽管存在类似于嵌合抗原受体T细胞疗法等可以实现肿瘤的靶向性，但却在实体瘤的治疗中进展缓慢。免疫细胞难以有效进入肿瘤组织是其中一个重要的原因。因此，改善免疫细胞的主动靶向性与穿透性是进一步提高抗肿瘤治疗效果的关键。
技术实现思路
本专利技术是在考虑到目前研究进展、临床迫切需求等信息后设计、实施的，其优势恰巧在于可以一定程度上克服上述局限。本专利技术利用含有穿透肽iRGD成分的物质作为实现肿瘤主动靶向性、高穿透性的分子，将其修饰一段脂质分子，形成一个能够明确增强肿瘤靶向性的多用肿瘤靶向插件。成功构建后经反复实验验证，本专利技术具有明确肿瘤靶向性，能够切实地增强免疫细胞、细胞膜制剂的肿瘤局部聚集，提高抗肿瘤治疗效果。本专利技术提供的技术方案是：实现主动肿瘤靶向、高穿透的含有穿透肽iRGD成分的脂质插件，该插件由含有高穿透肽iRGD的成分以及DSPE-PEG-MAL构成，可嵌插在多种载药体系、免疫细胞上，实现其主动肿瘤靶向性。所述含有高穿透肽iRGD的成分为iRGD、含有iRGD成分的多肽或融合蛋白如anti-EGFR-iRGD等以及含有iRGD成分的其他物质。所述的主动肿瘤靶向、高穿透的含有穿透肽iRGD成分的脂质插件的制备方法为：通过加成方法(如迈克尔加成法)将含有穿透肽iRGD的成分进行DSPE-PEG-MAL修饰，再进行细胞或者细胞膜插入，具体包括以下步骤：(1)含有穿透肽iRGD成分的脂质插件的制备方法：将含有穿透肽iRGD成分的多肽或蛋白与DSPE-PEG-MAL以一定比例在缓冲液(如HEPES缓冲液)中进行加成反应(如迈克尔加成反应)，在一定温度下置于摇床上孵育一段时间，反应后溶液进行多次透析，透析后液体制备成冻干粉备用，得到含有iRGD成分的多肽/蛋白-PEG-DSPE；(2)插件修饰：插件修饰细胞：将含有iRGD成分的多肽/蛋白-PEG-DSPE与细胞37℃孵育一定时间(如30分钟)，离心弃上清，用培养基重悬备用；或者插件修饰生物膜类制剂：将含有iRGD成分的多肽/蛋白-PEG-DSPE与生物膜类制剂37℃孵育一定时间(如30分钟)，孵育后离心(参数举例：14000rpm，15分钟)，弃上清，沉淀加入适量生理盐水重悬，探头超声一定时间(参数举例：30s)进行重悬。本专利技术还提供上述的主动肿瘤靶向、高穿透的含有穿透肽iRGD成分的脂质插件用于免疫治疗及其他抗肿瘤治疗，含有穿透肽iRGD成分的脂质插件作为肿瘤靶向分子在免疫治疗和生物膜载体中用于肿瘤的治疗。含有穿透肽iRGD成分的脂质插件嵌插至各种细胞(如免疫细胞)，作为提高细胞靶向性应用。细胞不受限于细胞类型及分子表型。所述肿瘤不限于肿瘤类型。含有穿透肽iRGD成分的脂质插件的液体制剂、粉剂，适于经直肠、鼻内、肺部、阴道内、外部、口服或肠胃外，包括皮下、植入、静脉内、腹腔和肌内给药。有益效果：1、本专利技术所制备的含有iRGD成分的多肽/蛋白-PEG-DSPE制备过程简单、不涉及有毒有机溶剂、可重复性好。2、高穿透性iRGD成分使修饰的细胞积聚于肿瘤局部，同时使细胞在肿瘤局部获得良好的穿透性，使其更多地进入肿瘤组织而发挥作用。3、高穿透性iRGD成分使修饰的细胞膜制剂积聚于肿瘤局部，并在肿瘤局部获得良好的穿透性，使其更多地进入肿瘤组织而发挥抗肿瘤作用。4、可选用生物膜为载体包载药物(如紫杉醇等模式药物)，将其用本专利技术所制备的含有iRGD成分的多肽/蛋白-PEG-DSPE修饰后，具有更好的肿瘤靶向性、穿透性及抗肿瘤作用，具体表现参见附图。附图说明图1——iRGD-PEG-DSPE连接T细胞。iRGD嵌插上T细胞后，在流式细胞仪上可以检测到穿透肽iRGD的荧光峰向右偏移，证明iRGD已连接至T细胞。图2——iRGD-PEG-DSPE连接10^6个T细胞饱和量。iRGD-PEG-DSPE连接10^6个T细胞饱和量在3ug左右。图3——iRGD、iRGD-PEG-DSPE对T细胞活力的影响。iRGD-PEG-DSPE对T细胞活力的影响与iRGD组相比无明显差异。图4——iRGD、iRGD-PEG-DSPE对T细胞增殖能力的影响。游离iRGD+T细胞组、iRGD嵌插T细胞组与单独T细胞组相比，增殖能力未见明显改变。图5——iRGD、iRGD-PEG-DSPE对T细胞体外杀伤能力的影响(靶细胞SNU719)。游离iRGD+T细胞组、iRGD嵌插T细胞组与单独T细胞组相比，对肿瘤细胞SNU719的杀伤能力类似。图6——T细胞三维球穿透实验。iRGD嵌插T细胞组中，T细胞对肿瘤三维球的渗透明显强于单独T细胞组及游离iRGD+T细胞组。图7——T细胞肿瘤组织靶向浸润实验(共聚焦结果图)。本实验中，绿色荧光代表的T细胞，iRGD嵌插T细胞组的肿瘤组织中的绿色荧光明显强于游离iRGD+T细胞组及单独T细胞组。图8——T细胞肿瘤组织靶向浸润实验(近红外结果图)。本实验中，iRGD嵌插T细胞组肿瘤组织处的信号明显强于游离iRGD+T细胞组及单独T细胞组。图9——T细胞抑瘤实验。相比于对照组、单独T细胞组及游离iRGD+T细胞组，iRGD嵌插T细胞组的肿瘤体积平均值最小，提示该组具有更好的抗肿瘤作用。图10——anti-EGFR-iRGD脂链修饰。图中泳道1系标准蛋白分子量，泳道2是表达纯化后的anti-EGFR-iRGD融合蛋白，泳道3是anti-EGFR-iRGD脂链修饰后产物，泳道4是空白脂链，1、2、4泳道分别作为标准参照、阳性参照、内部参照。图11——验证纳米抗体融合蛋白嵌插入生物膜。图11系流式细胞仪检测结果，从左至右，第一幅图是空白细胞本底，第2幅图系anti-EGFR-iRGD脂链修饰后，分别验证了红细胞、白细胞、肿瘤细胞(由上至下)等多种不同细胞。图12——纳米抗体融合蛋白与参照药物共定位验证。图12中蓝色为肿瘤细胞核，绿色为包载的模式药物，红色为纳米抗体融合蛋白。由图可见，三者定位关系良好。图13——纳米抗体融合蛋白修饰对于所包载药物抗肿瘤作用的影响。从图13中可以看出，纳米抗体融合蛋白的嵌插修饰并未降低模式药物体外对肿瘤细胞株的抗肿瘤作用。图14——体内肿瘤靶向性。近红外结果显示，与单纯模式药物相比，纳米抗体融合蛋白修饰后的荷瘤动物皮下瘤具有较强的荧光信号。这提示嵌插修饰的模本文档来自技高网...

【技术保护点】
实现高穿透性肿瘤靶向脂质插件的构建，其特征在于：该插件由含有高穿透肽iRGD的成分以及磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇‑马来酰亚胺DSPE‑PEG‑MAL构成，可嵌插在多种载药体系、免疫细胞上，实现其主动肿瘤靶向性。

【技术特征摘要】
1.实现高穿透性肿瘤靶向脂质插件的构建，其特征在于：该插件由含有高穿透肽iRGD的成分以及磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺DSPE-PEG-MAL构成，可嵌插在多种载药体系、免疫细胞上，实现其主动肿瘤靶向性。2.根据权利要求1所述的实现主动肿瘤靶向、高穿透的含有穿透肽iRGD成分的脂质插件，其特征在于：所述含高穿透肽iRGD的成分为iRGD或含有iRGD的多肽或者融合蛋白。3.根据权利要求2所述的实现主动肿瘤靶向、高穿透的含有穿透肽iRGD成分的脂质插件，其特征在于：所述含高穿透肽iRGD的多肽或者融合蛋白包括anti-EGFR-iRGD。4.权利要求1所述的主动肿瘤靶向、高穿透的含有穿透肽iRGD成分的脂质插件的制备方法，其特征在于：将含有穿透肽iRGD的成分进行DSPE-PEG-MAL修饰，再进行细胞或者细胞膜插入，具体包括以下步骤：(1)含有穿透肽iRGD成分的脂质插件的制备方法：将含有穿透肽iRGD成分的多肽、蛋白或其他物质与DSPE-PEG-MAL以一定比例在缓冲液中进行反应，孵育一定时间，反应后的溶液经透析后，液体制备成冻干粉备用，得到含有iRGD成分的多肽/蛋白-PEG-DSPE；(2)插件修饰：插件修饰细胞：将含有iRGD成分的多肽/蛋白-PEG-DSPE或其...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘宝瑞，沙慧子，丁乃清，
申请(专利权)人：南京鼓楼医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32