本发明专利技术涉及生物领域，公开了保藏编号为CCTCC?NO：M?2011378的双基因共表达重组质粒pAdTrack-CMV-IL-24-polyA-promoter-OSM，以及由该质粒制备的重组腺病毒Ad-IL-24-polyA-promoter-OSM。本发明专利技术通过在Ad-polyA-promoter空载体间亚克隆入IL-24基因和OSM基因构建IL-24和OSM双基因共表达重组质粒，并与腺病毒pAdEasy-1同源重组在QBI-293A细胞中包装产生重组腺病毒。所述重组腺病毒对抑制黑色素瘤以及鼻咽癌的肿瘤细胞具有增效作用，同时对鼻咽癌肿瘤细胞的放疗增敏具有增效作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物领域，具体涉及IL-M和OSM双基因共表达重组质粒和重组腺病毒以及应用。
技术介绍
近年来，恶性肿瘤中的皮肤恶性黑色素瘤以及鼻咽癌发病率呈逐年上升趋势。其中，皮肤恶性黑色素瘤(cutaneous malignant melanoma, CMM)是一种恶性程度很高的皮肤肿瘤，它的发生往往开始于那些色素沉着的部位，通常是由镶嵌在表皮的基底细胞中的生黑素细胞不受细胞增殖机制控制衍生的。最近的一些报道显示我国的发病率有逐渐增高的趋势，由于对其严重性认识不足，一般就诊时往往已是晚期。而鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我国高发肿瘤之一，广东、广西、福建、湖南等省为国内高发区。鼻咽癌的发生发展是一个多因素作用、多基因参与、多阶段病变发生的极其复杂的癌变过程，它的发病率和死亡率均随年龄增长而上升，是人类健康的重大威胁。肿瘤是当今社会影响人类健康的主要疾病之一，肿瘤的发生发展受体内多种原因的调控，肿瘤抑制基因正是参与这一调控的重要分子。很多肿瘤中都有某些肿瘤抑制基因的失活，向缺失某种抑癌基因的细胞内导入正常的抑癌基因，则可逆转肿瘤细胞的表型、抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞死亡，从而达到治疗目的，这种方法称之为基因治疗。基因治疗作为一种高效性、特异性、靶向性的治疗手段已是医学界广泛关注的热点，基因治疗技术的出现为治疗皮肤恶性黑色素瘤以及鼻咽癌指明了发展方向。现阶段，已经有多篇文章报道了有关抑制黑色素瘤以及鼻咽癌的基因，例如白细胞介素-24(IL-24)基因和抑瘤素(OSM)基因。白细胞介素-24(IL-24)又称黑色素瘤分化相关因子-7 (mda-7)，为分泌型细胞因子，是一种膜受体介导的肿瘤生长抑制因子，它是第一个既抑制肿瘤细胞生长和血管形成并诱导其凋亡同时又能刺激免疫细胞表达细胞因子的新型抑癌基因。迄今为止已有许多实验证明IL-M具有显著的抑制肿瘤的作用，能选择性地抑制多种肿瘤生长，诱导肿瘤细胞凋亡，包括黑色素瘤、神经胶质母细胞瘤、骨肉瘤、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、肺癌、胃癌、鼻咽癌、前列腺癌等。这种抑制作用不依赖p53、Rb和pl6 等抑癌基因，且对正常细胞没有影响。抑瘤素(OSM)是IL-6细胞因子家族的成员之一，是一种多功能的细胞因子，具有调节基因活性、调节细胞增殖与分化、调节免疫、参与炎症反应、重塑细胞外基质、造血、神经系统保护等多种功能，此外，OSM还能对多种肿瘤细胞产生抑制作用。将上述抑癌基因通过载体携带转染或感染靶细胞，便可实现基因治疗皮肤恶性黑色素瘤以及鼻咽癌，达到抑制肿瘤细胞的效果。基因治疗中应用的载体可分为两类非病毒式和病毒式。这两者中病毒介导法转染效率高，目的基因表达稳定，在现有的基因治疗方案中占绝大多数。目前用于基因治疗的常用病毒式载体有逆转录病毒载体、腺病毒载体、 腺病毒相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体和嵌合病毒载体等。而本领域技术人员公知腺病毒载体与其它病毒载体相比较而言，有很多优点，如1、宿主范围广，对人致病性低；2、具有感染率高、对分裂和非分裂细胞都能感染；3、能携带很长的治疗基因和同时表达多个基因； 4、不整合到染色体中，无插入致突变性，安全性好；5、能有效进行增殖，滴度高，易加工制备等。而采用腺病毒载体中的PAdEasy腺病毒表达系统更具许多特殊优点1.腺病毒质粒的同源重组可在大肠杆菌BJ5183中高效进行，且细菌繁殖快，同源重组能力强，因而从根本上克服细胞内同源重组率低的缺陷；2.腺病毒中可插入111Λ的基因片段或同时插入多个基因片段；3.由于在腺病毒骨架中含有的GFP报告基因，非常便于监测病毒包装成功与否、 检测病毒滴度及感染效率等。所有这些都避免了病毒的空斑克隆纯化过程，大大减少了病毒的制备时间。虽然通过基因治疗皮肤恶性黑色素瘤以及鼻咽癌有诸多优点，但是目前以腺病毒为载体同源重组IL-M基因或OSM基因后对肿瘤细胞的抑制作用不高，限制了基因治疗技术在皮肤恶性黑色素瘤以及鼻咽癌中的应用。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的是提供一种双基因共表达重组质粒以及利用该重组质粒制备的同源重组腺病毒，使得所述同源重组腺病毒对抑制黑色素瘤以及鼻咽癌的肿瘤细胞具有增效作用，同时对鼻咽癌肿瘤细胞的放疗增敏具有增效作用。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案一种 IL-24 与 OSM 双基因共表达重组质粒 pAdTrack-CMV-IL-24-polyA-promoter -0SM，其保藏号为 CCTCC NO :M2011378o所述双基因共表达重组质粒的基因IL-M和基因OSM已被Genebank公开，其中本专利技术所引入的基因IL-M核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，基因OSM核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。本专利技术还提供所述双基因共表达重组质粒与腺病毒pAdEasy-Ι同源重组获得的重组腺病毒质粒 pAdEasy-l-pAcTTrack-CMV-IL-M-polyA-promoter-OSM。本专利技术还提供所述双基因共表达重组质粒与腺病毒pAdEasy-1同源重组，并在包装细胞中包装产生的重组腺病毒Ad-IL-M-polyA-promoter-OSM (以下简写为 Ad-IL-24-OSM)。其中，所述包装细胞优选为QBH93A。针对利用IL-M或OSM的单基因表达重组质粒获得的同源重组腺病毒对黑色素瘤以及鼻咽癌的肿瘤细胞抑制作用不高的问题，本专利技术基于在IL-M和OSM双基因之间插入 polyA-promotoHCMV)双启动子表达盒构建双基因共表达载体的构想，在申请人已成功构建的pAdTrack-CMV-polyA-promoter转移质粒(质粒图谱见图1)的基础上，在Bgl IKSal I酶切位点间插入IL-M片段，在Not I、Xho I酶切位点间插入OSM片段(见图2)，构建出本专利技术所述双基因共表达重组质粒pAcTrrack-CMV-IL-24-polyA-promoter-OSM。本专利技术所述双基因共表达重组质粒经PCR和双酶切鉴定表明，由polyA-promoter 介导的IL-M和OSM双基因共表达重组质粒构建成功。此外，RT-PCR以及Wfestern blot鉴定结果表明，本专利技术所述重组腺病毒Ad-IL-M-OSM能够介导外源性IL-M和OSM基因的转录和表达，表明利用本专利技术所述双基因共表达重组质粒成功获得了 IL-M和OSM双基因共表达重组腺病毒。本专利技术所述双基因共表达重组质粒将带有polyA-promotoHCMV)各自独立启动子的两个表达盒构建于一个质粒上，IL-M和OSM双基因各自独立转录出两种不同的mRNA， 在重组腺病毒中各自独立翻译出不同的蛋白，这两种蛋白协同作用增加彼此抑制黑色素瘤以及鼻咽癌肿瘤细胞的作用，并增加相关促凋亡因子的表达量，具有显著的增效作用。本专利技术还提供所述双基因共表达重组质粒和重组腺病毒在制备治疗皮肤恶性黑色素瘤以及鼻咽癌药物中的应用。在体外抑制黑色素瘤以及鼻咽癌肿瘤细胞的各项试验中，本专利技术所述重组腺病毒 Ad-IL-24-OSM与利用IL-M或OSM的单基因表达重组质粒获得的同源重组腺病毒(以下简称Ad-IL-M和Ad-OSM)在相同感染复数的前提下对两种肿瘤细胞进本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨吉成，缪竞诚，刘济生，盛伟华，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：
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