本发明专利技术公开了一种用于评价嗜酸乳杆菌免疫调节作用的方法及应用，属于生物技术领域。本发明专利技术所提供的方法为对与免疫相关的差异表达基因的动态变化情况进行检测；所述差异表达基因包括：上调的免疫相关基因CCL2、CCL20、IL1α、IL1β、IL6ST、IL8、PTX3、TNFRSF9和下调的免疫相关基因CXCR4。本发明专利技术方法只需要检测九种免疫相关基因就可以评估嗜酸乳杆菌的免疫调节作用，同时利用Real Time PCR可以实现快速检测，大大节约时间，克服了现有的嗜酸乳杆菌免疫调节功能评价的不足，本发明专利技术方法在小鼠试验中以及Caco‑2细胞中均得到了较好的验证。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于评价嗜酸乳杆菌免疫调节作用的方法及应用，属于生物
技术介绍
益生乳酸菌是一群能够粘附于宿主肠道后通过定植作用改变宿主某一部位菌群组成，从而对宿主发挥多种有益作用的活的微生物。研究表明，其在维持肠道微生态平衡、增强机体免疫机能、降低血清胆固醇和预防及抑制肿瘤发生等方面发挥着重要的作用，是维持机体健康必不可少的生理菌群之一。肠道正常菌群紊乱会导致口服免疫耐受丧失，甚至会引起系统性的超敏反应，这些细菌是胃肠道或系统免疫稳态维持不可缺少的重要组成部分。国内外已有大量实验证实体内的多种乳酸菌可对免疫系统产生调节作用，嗜酸乳杆菌(NCFM)作为研究的一种模式菌株，能够调节宿主特异性及非特异性免疫反应，且可能对局部细胞因子分泌以及局部免疫反应有影响。目前普遍认为嗜酸乳杆菌(NCFM)需经吸附、定植至肠道上皮细胞，然后发挥益生及免疫调节作用。Caco-2细胞体外吸附试验模型和动物(小鼠)益生菌体内灌胃试验模型是评价免疫调节作用常用的研究方法。Caco-2细胞在特定体外培养条件下可自发进行上皮样分化形成紧密连接，其形态学、结构功能、标志酶的功能表达等都与小肠上皮细胞类似，因而被广泛应用于乳酸菌的肠道粘附评估和药物等物质肠道吸收代谢实验中。小鼠试验模型则更加直观的评价嗜酸乳杆菌(NCFM)免疫调节作用的效果。现阶段对嗜酸乳杆菌免疫调节作用的评价主要依据《保健食品功能学评价程序和检验方法》中所规定的脏器/体重比值、细胞免疫功能测定、体液免疫功能测定、巨噬细胞功能测定和NK细胞活性测定相关方法，但仅仅依据某一检测指标的阳性或阴性结果来判断是否具有免疫调节作用对全面、有效、整体化的评价有一定局限性。因此，建立一种快速、准确的通过确定和检测与免疫调节功能紧密相关的细胞因子和趋化因子来评价嗜酸乳杆菌免疫调节作用的方法显得尤为重要。
技术实现思路
为解决现有技术的不足，本专利技术提供了一种用于评价嗜酸乳杆菌免疫调节作用的方法，采用的技术方案如下：本专利技术的目的在于提供一种用于评价嗜酸乳杆菌免疫调节作用的方法，该方法是对与免疫相关的差异表达基因的动态变化情况进行检测；所述差异表达基因包括：上调的免疫相关基因CCL2、CCL20、IL1α、IL1β、IL6ST、IL8、PTX3、TNFRSF9和下调的免疫相关基因CXCR4。优选地，所述方法是利用RealTimeRT-PCR对与免疫相关的差异表达基因的动态变化情况进行检测；所述差异表达基因包括：上调的免疫相关基因CCL2、CCL20、IL1α、IL1β、IL6ST、IL8、PTX3、TNFRSF9和下调的免疫相关基因CXCR4。更优选地，所述的方法，其特征在于，步骤如下：1)将嗜酸乳杆菌与宿主细胞共培养后提取宿主细胞的总RNA，或将嗜酸乳杆菌菌悬液给受体食用后提取受体的肠组织的总RNA，获得总RNA；2)利用步骤1)所得的总RNA通过反转录获得cDNA，以cDNA为模板，根据差异表达基因CCL2、CCL20、IL1α、IL1β、IL6ST、IL8、PTX3、TNFRSF9和CXCR4的特异性上下游引物进行扩增，以GAPDH作为内参基因进行RealTimeRT-PCR检测，分析各个所述差异表达基因在mRNA水平的表达情况。优选地，步骤1)所述嗜酸乳杆菌为嗜酸乳杆菌NCFM。优选地，步骤1)所述宿主细胞，为Caco-2细胞；优选地，当宿主细胞为Caco-2细胞时，步骤2)所述GAPDH的特异性上、下游引物如SEQIDNO.1-2所示；所述CCL2的特异性上、下游引物如SEQIDNO.3-4所示；所述CCL20的特异性上、下游引物如SEQIDNO.5-6所示；所述IL1α的特异性上、下游引物如SEQIDNO.7-8所示；所述IL1β的特异性上、下游引物如SEQIDNO.9-10所示；所述IL6ST的特异性上、下游引物如SEQIDNO.11-12所示；所述IL8的特异性上、下游引物如SEQIDNO.13-14所示；所述PTX3的特异性上、下游引物如SEQIDNO.15-16所示；所述TNFRSF9的特异性上、下游引物如SEQIDNO.17-18所示；所述CXCR4的特异性上、下游引物如SEQIDNO.19-20所示。优选地，步骤1)所述受体，为小鼠；当受体为小鼠时，步骤2)所述GAPDH的特异性上、下游引物如SEQIDNO.21-22所示；所述CCL2的特异性上、下游引物如SEQIDNO.23-24所示；所述CCL20的特异性上、下游引物如SEQIDNO.25-26所示；所述IL1α的特异性上、下游引物如SEQIDNO.27-28所示；所述IL1β的特异性上、下游引物如SEQIDNO.29-30所示；所述IL6ST的特异性上、下游引物如SEQIDNO.31-32所示；所述IL8的特异性上、下游引物如SEQIDNO.33-34所示；所述PTX3的特异性上、下游引物如SEQIDNO.35-36所示；所述TNFRSF9的特异性上、下游引物如SEQIDNO.37-38所示；所述CXCR4的特异性上、下游引物如SEQIDNO.39-40所示。优选地，步骤2)所述差异表达基因CCL2、CCL20、IL1α、IL1β、IL6ST、IL8、PTX3、TNFRSF9和CXCR4的筛选方法为：通过对嗜酸乳杆菌NCFM作用后的肠道细胞的基因表达谱进行分析，根据基因表达谱分析的结果，利用GeneOntology分类标准进行筛选得到的。优选地，步骤2)所述RealTimeRT-PCR，反应程序为：95℃，10s预变性；95℃，5s；60℃，34s，40个循环。优选地，所述评价嗜酸乳杆菌具有免疫调节作用的判定方法，是基因CCL2、CCL20、IL1α、IL1β、IL6ST、IL8、PTX3、TNFRSF9表达上调且基因CXCR4表达下调。本专利技术还提供了一种上述任一方法在评价乳酸菌免疫调节作用中的应用。本专利技术有益效果：本专利技术根据嗜酸乳杆菌(NCFM)免疫调节相关研究结果，提供了一种可以快速有效的评价嗜酸乳杆菌免疫调节作用的方法，该方法只需要检测九种免疫相关基因就可以评估嗜酸乳杆菌的免疫调节作用，同时利用RealTimePCR(RT-PCR)可以实现快速评估，大大节约时间；本专利技术还针对Caco-2细胞和小鼠细胞为受体的情况下，分别设计了进行RealTimePCR反应的特异性引物，在小鼠试验中以及Caco-2细胞中均得到了较好的验证。本专利技术克服了现有的嗜酸乳杆菌免疫调节功能评价的不足，可以客观评价嗜酸乳杆菌对宿主的免疫调节作用。附图说明图1为Caco-2细胞的形态(×400)。图2为总RNA琼脂糖凝胶电泳图；(1，对照：无NCFM作用Caco-2细胞；2，NCFM作用Caco-2细胞2h)。图3RealTimeRT-PCR检测免疫相关基因的扩增曲线。图4总RNA琼脂糖凝胶电泳图；(1，对照：无NCFM作用Caco-2细胞)；2，3，4，5分别为嗜酸乳杆菌NCFM作用Caco-2细胞2、4、8和12h)。图5RealTimeRT-PCR检测免疫相关基因表达的扩增曲线；(1，2，3，4分别为嗜酸乳杆菌NCFM作用于Caco-2细胞2、4、8和12h)。图6嗜酸乳杆菌NCFM作用后Caco-2细胞相本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于评价嗜酸乳杆菌免疫调节作用的方法，其特征在于，对与免疫相关的差异表达基因的动态变化情况进行检测；所述差异表达基因包括：上调的免疫相关基因CCL2、CCL20、IL1α、IL1β、IL6ST、IL8、PTX3、TNFRSF9和下调的免疫相关基因CXCR4。
【技术特征摘要】
1.一种用于评价嗜酸乳杆菌免疫调节作用的方法，其特征在于，对与免疫相关的差异表达基因的动态变化情况进行检测；所述差异表达基因包括：上调的免疫相关基因CCL2、CCL20、IL1α、IL1β、IL6ST、IL8、PTX3、TNFRSF9和下调的免疫相关基因CXCR4。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤如下：1)将嗜酸乳杆菌与宿主细胞共培养后提取宿主细胞的总RNA，或将嗜酸乳杆菌菌悬液给受体食用后提取受体的肠组织的总RNA，获得总RNA；2)利用步骤1)所得的总RNA通过反转录获得cDNA，以cDNA为模板，根据差异表达基因CCL2、CCL20、IL1α、IL1β、IL6ST、IL8、PTX3、TNFRSF9和CXCR4的特异性上下游引物进行扩增，以GAPDH作为内参基因进行RealTimeRT-PCR检测，分析各个所述差异表达基因在mRNA水平的表达情况。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)所述嗜酸乳杆菌为嗜酸乳杆菌NCFM。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)所述宿主细胞，为Caco-2细胞。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)所述GAPDH的特异性上、下游引物如SEQIDNO.1-2所示；所述CCL2的特异性上、下游引物如SEQIDNO.3-4所示；所述CCL20的特异性上、下游引物如SEQIDNO.5-6所示；所述IL1α的特异性上、下游引物如SEQIDNO.7-8所示；所述IL1β的特异性上、下游引物如SEQIDNO.9-10所示；所述IL6ST的特异性上、下游引物如SEQIDNO.11-12所示；所述IL8的特异性上、下游引物如SEQIDNO.13-14所示；所述PTX3的特异性上、下游引物如SEQIDNO.15-16所示；所述T...
【专利技术属性】
技术研发人员：姜毓君，满朝新，王辉，林官根，李明雨，
申请(专利权)人：黑龙江省绿色食品科学研究院，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23
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