一种鉴别酸浆的核苷酸序列、特异性标记引物和方法技术

本发明专利技术涉及一种鉴别酸浆的核苷酸序列、特异性标记引物和方法。本发明专利技术鉴别酸浆的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。用于鉴别酸浆的特异性标记引物上游序列ST5SJF：如SEQ ID NO.2所示；下游序列ST5SJR：如SEQ ID NO.3所示。利用特异性标记引物ST5SJF/ST5SJR，通过常规PCR方法来鉴别酸浆。本发明专利技术ST5SJF/ST5SJR酸浆特异性标记引物，若为其他酸浆属植物样品，为阴性反应，能够实现酸浆样品的快速准确鉴别。该方法简便、准确，且耗时短，半日即可完成。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种鉴别酸浆Physalisalkekengivar.franchetii的核苷酸序列、特异性标记引物，以及一种利用该特异性引物对酸浆进行快速鉴别的方法。
技术介绍
酸浆Physalisalkekengivar.franchetii是茄科(Solanaceae)酸浆属(Physalis)一年生草本植物，又名锦灯笼、挂金灯。其原产于我国，在我国南北地区均有分布，多生长于田边、路旁、林缘、荒地，等。酸浆果实含有丰富的β－胡萝卜素、维生素C、Ca等多种矿物质和人体所需的18种氨基酸，可以生吃，也可以加工成果汁、罐头等。酸浆是我国重要的传统中药材，最早记录于《神农本草经》，现被《中华人民共和国药典》(2015版)收录。酸浆宿萼含有甾体类、甾醇、黄酮及酸浆苦味素等重要化学成分，其具有清热解毒、利咽化痰、利尿通淋之功效，可以用于咽喉音哑、痰热咳嗽、小便不利、热淋涩痛、湿疹、天疱疮等治疗。酸浆与小酸浆P.minima、苦蘵P.angulata及毛酸浆Physalispubescens的叶、花及果实形状相似度非常高，利用形态学鉴别方法很难将酸浆与其它三种酸浆属植物区分开。因而，经常会发生将小酸浆、苦蘵及毛酸浆错误鉴定为酸浆的情况，这为酸浆资源的安全使用和保护带来了很大困难。对酸浆属植物的鉴别主要依据表观特征，但是酸浆属植物的表型特征十分相似，且形状特征易受生境、气候、生理状况等的影响而常常导致主观辨别上的偏差，因此，仅靠细微表型差异难以准确鉴定酸浆属植物种类。DNA分子标记尤其是特异性分子标记技术弥补和克服了传统分类方法的一些缺陷和难题，可以通过基因序列差异比较分析为植物鉴别、系统分类提供直接的证据。本专利首先运用SCoT标记方法，采用PCR技术获得酸浆属植物SCoT指纹图谱。经过大量筛选实验，获得酸浆特异性条带，通过切胶回收、TA克隆、测序等方法，开发获得酸浆特异性标记引物，对有效的鉴别和保护酸浆种质资源具有非常重要的意义。该方法具有快速、简便、成本低、准确度高的特点，迄今为止，尚未有特异性分子标记应用于酸浆鉴别的研究报道。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是针对现有技术的不足，提供了一种鉴别酸浆的特征性核苷酸序列。本专利技术采用PCR技术，利用SCoT标记，经过大量筛选实验，获得酸浆特异性DNA片段，通过切胶回收、TA克隆、测序，获得该DNA序列。具体序列为：CAACAATGGCTACCACGAGACACAAAAGGGTGTGGGGCTTCTTTAGGGGATTAGTTTTTCCGCTCTATATGATAACCATACATTTGGTAGTAGCAGGACATACCCTCGAATAGATCTTTGGACAATTGGTAGCCTTTGAAGAGGCTTATCATGAAACTTATGGTATGGGTGGTCAGGGAGTTCACCAGACGACGAGGACTGGTAGTGATCCATCTCGGGGTCGGAAAGATGAGGATCCCACGAGTTGTTTCATATGTGGTAGGTTTGGACACAAGGCCATGGAATGTTCCCTCCATGGGACTTTTTTATTGCAGCGACTTGAGCTGAGTAGTCAAGATTCAGGACAGATTCATCCAATTTTGCCTTCGGGTTCTCAAAACCTTTCTAATGATATCCGATCAGTAAGTAGAGGATGTGATAGACAGACTTATCAACCGCTGAGATTTCAACATCACGATCGATTGGGTCAGTACAGAGGCCAGAGCAGCCAGGGTAGCCAACTTGTTAGGGGTGCATCTTCGGGTTCAAGAGGTCGTGGTAGCCATTGTTG，如SEQIDNO.1所示；本专利技术的第二个目的是提供基于上述酸浆特征性核苷酸序列设计的鉴别酸浆的特异性标记引物(ST5SJF/ST5SJR)，该引物序列如下：ST5SJF:5’-AGGGTGTGGGGCTTCTTTA-3’，如SEQIDNO.2所示；ST5SJR:5’-GGCTGCTCTGGCCTCTGTA-3’，如SEQIDNO.3所示；上述特异性引物(ST5SJF/ST5SJR)，具有非常高的特异性，以该引物对酸浆属植物进行PCR扩增，只与酸浆样本DNA发生反应，获得463bp大小的特异性片段，而不与其他酸浆属植物样品反应。运用该特异性引物，通过常规PCR反应即可以快速鉴别出酸浆样品。本专利技术的第三个目的是提供一种利用上述特异性标记引物对酸浆进行快速鉴别的方法。本专利技术采用上述引物组合(ST5SJF/ST5SJR)作为特异性扩增引物，以待测酸浆属植物基因组DNA为模板，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现463bp大小的特异性片段，则待测酸浆属植物样品为酸浆，反之则不是。本专利技术有益效果主要体现为：ST5SJF/ST5SJR酸浆特异性标记引物，若为其他酸浆属植物样品，为阴性反应，能够实现酸浆样品的快速准确鉴别。该方法简便、准确，且耗时短，半日即可完成。附图说明图1是本专利技术所述的酸浆的特征性核苷酸序列及对酸浆特异性引物ST5SJF和ST5SJR的位置图，左侧为5’端，右侧为3’端，其中黑色部分为特异性引物ST5SJF/ST5SJR扩增的序列片段大小及位置；图2是按照常规PCR方法，运用SCoT标记对酸浆属植物样品进行PCR扩增，经过大量筛选实验，获得的具有酸浆特征性条带的电泳图(箭头所指的条带是酸浆特有的条带，分子量为550bp)，其中M为DNA分子量标准markerDL2000；通道1～4：小酸浆P.minima；5～13：苦蘵P.angulata；14～17：酸浆P.alkekengivar.franchetii；18～20：毛酸浆P.pubescens。图3是运用本专利技术设计的特异性标记引物ST5SJF/ST5SJR对酸浆属植物样品进行PCR扩增后的电泳图，其中M为DNA分子量标准markerDL2000；通道1～4：小酸浆P.minima；5～13：苦蘵P.angulata；14～17：酸浆P.alkekengivar.franchetii；18～20：毛酸浆P.pubescens。电泳图显示只有酸浆样品扩增出分子量为463bp的特异性DNA条带。具体实施方式本专利技术可以从分子水平上较为快速准确的鉴别酸浆植物，通过以下实施例对本专利技术做进一步说明，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：实施例1：酸浆特征性核苷酸序列的制备1.基因组DNA的提取剪取酸浆属植物样品(包括小酸浆4个样品、苦蘵9个样品、酸浆4个样品、以及毛酸浆3个样品)新鲜叶片100mg放入研钵，立即加入液氮研磨至粉末，然后使用UNIQ-10柱式植物基因组DNA抽提试剂盒(购于上海生工生物工程有限公司)提取基因组DNA，所得DNA用0.8％琼脂糖胶进行电泳检测，并用紫外分光光度计检测浓度，稀释至50ng/μl。2.SCoT–PCR扩增，电泳检测运用SCoT标记对酸浆属植物进行PCR扩增，引物由上海生工生物工程有限公司合成，反应体系(总体积20μl)：2μl10×Buffer，2μlMgCl2(25mM)，0.8μldNTPs(10mM)，1μl引物(10μM)，0.5μlTaq酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴别酸浆的核苷酸序列，其特征在于该核苷酸序列为：CAACAATGGCTACCACGAGACACAAAAGGGTGTGGGGCTTCTTTAGGGGATTAGTTTTTCCGCTCTATATGATAACCATACATTTGGTAGTAGCAGGACATACCCTCGAATAGATCTTTGGACAATTGGTAGCCTTTGAAGAGGCTTATCATGAAACTTATGGTATGGGTGGTCAGGGAGTTCACCAGACGACGAGGACTGGTAGTGATCCATCTCGGGGTCGGAAAGATGAGGATCCCACGAGTTGTTTCATATGTGGTAGGTTTGGACACAAGGCCATGGAATGTTCCCTCCATGGGACTTTTTTATTGCAGCGACTTGAGCTGAGTAGTCAAGATTCAGGACAGATTCATCCAATTTTGCCTTCGGGTTCTCAAAACCTTTCTAATGATATCCGATCAGTAAGTAGAGGATGTGATAGACAGACTTATCAACCGCTGAGATTTCAACATCACGATCGATTGGGTCAGTACAGAGGCCAGAGCAGCCAGGGTAGCCAACTTGTTAGGGGTGCATCTTCGGGTTCAAGAGGTCGTGGTAGCCATTGTTG，如SEQ ID NO.1所示。...

【技术特征摘要】
1.一种鉴别酸浆的核苷酸序列，其特征在于该核苷酸序列为：CAACAATGGCTACCACGAGACACAAAAGGGTGTGGGGCTTCTTTAGGGGATTAGTTTTTCCGCTCTATATGATAACCATACATTTGGTAGTAGCAGGACATACCCTCGAATAGATCTTTGGACAATTGGTAGCCTTTGAAGAGGCTTATCATGAAACTTATGGTATGGGTGGTCAGGGAGTTCACCAGACGACGAGGACTGGTAGTGATCCATCTCGGGGTCGGAAAGATGAGGATCCCACGAGTTGTTTCATATGTGGTAGGTTTGGACACAAGGCCATGGAATGTTCCCTCCATGGGACTTTTTTATTGCAGCGACTTGAGCTGAGTAGTCAAGATTCAGGACAGATTCATCCAATTTTGCCTTCGGGTTCTCAAAACCTTTCTAATGATATCCGATCAGTAAGTAGAGGATGTGATAGACAGACTTATCAACCGCTGAGATTTCAACATCACGATCGATTGGGTCAGTACAGAGGCCAGAGCAGCCAGGGTAGCCAACTTGTTAGGGGTGCATCTTCGGGTTCAAGAGGTCGTGGTAGCCATTGT...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯尚国，焦凯丽，姜梦莹，卢江杰，沈晨佳，王慧中，
申请(专利权)人：杭州师范大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33