GM-CSF和MART-1双基因共表达重组载体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种GM-CSF和MART-1双基因共表达重组载体，其沿载体转录方向依次连接有GM-CSF基因、IRES序列和MART-1基因，或者沿载体转录方向依次连接有MART-1基因、IRES序列和GM-CSF基因；所述GM-CSF基因的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:1所示，所述MART-1基因的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:3所示。本发明专利技术所述的双基因共表达重组载体，采用IRES序列来连接GM-CSF基因和MART-1基因，能够在同一载体中同时表达人黑色素瘤分化抗原和粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子，该重组载体可用于黑色素瘤的基因免疫治疗，既能发挥细胞因子的免疫调节作用，又能靶向性地针对黑色素瘤产生特异性抗肿瘤效应。

【技术实现步骤摘要】
GM-CSF和MART-1双基因共表达重组载体及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种重组载体及其制备方法和应用，特别是涉及一种双基因共表达重组载体及其制备方法和应用。
技术介绍
黑色素瘤(Melanoma),又称恶性黑色素瘤(Malignant Melanoma,MM),是来源于神经嵴黑色素细胞的恶性肿瘤，多发生于皮肤体表，亦可见于脉络膜、软脑膜及消化道等，其恶性程度高，是体表肿瘤中死亡率最高的恶性肿瘤。近年来,黑色素瘤的发病率及相应的死亡率在迅速增长，且发病年龄愈来愈早，严重威胁着人类的健康。黑色素瘤的传统治疗,是包括手术、化疗、免疫治疗等在内的综合治疗。目前唯一有效的治疗方法是在肿瘤厚度小于I毫米时通过手术切除肿瘤，但由于黑色素瘤的高度侵袭转移性和对多种化疗药物的耐药性，导致其疗效不佳以及预后不良。针对肿瘤患者普遍存在免疫力低下的情况,通过免疫治疗来诱导机体的特异性抗肿瘤免疫反应，以抑制肿瘤的生长、转移及复发。近年来，携带外源特异性肿瘤抗原的疫苗已成为肿瘤免疫治疗的新方向，包括基因疫苗、肿瘤细胞疫苗、细菌疫苗、病毒疫苗及树突状细胞疫苗等。其中，基因疫苗是通过特定载体将具本文档来自技高网...

【技术保护点】
GM?CSF和MART?1双基因共表达重组载体，其沿载体转录方向依次连接有GM?CSF基因、IRES序列和MART?1基因，或者沿载体转录方向依次连接有MART?1基因、IRES序列和GM?CSF基因；所述GM?CSF基因的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:1所示，所述MART?1基因的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:3所示。

【技术特征摘要】
1.GM-CSF和MART-1双基因共表达重组载体，其沿载体转录方向依次连接有GM-CSF基因、IRES序列和MART-1基因，或者沿载体转录方向依次连接有MART-1基因、IRES序列和GM-CSF 基因； 所述GM-CSF基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述MART-1基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO:3所示。2.根据权利要求1所述的GM-CSF和MART-1双基因共表达重组载体，其特征在于:所述的载体为PIRES2-EGFP质粒载体，所述的双基因共表达重组载体为pIRES2-GM-CSF-MART_l重组载体；其中，GM-CSF基因位于IRES序列的上游，MART-1基因位于IRES序列的下游。3.根据权利要求1所述的GM-CSF和MART-1双基因共表达重组载体，其特征在于:所述的载体为PIRES2-EGFP质粒载体，所述的双基因共表达重组载体为pIRES2-MART-l-GM_CSF重组载体；其中，MART-1基因位于IRES序列的上游，GM-CSF基因位于IRES序列的下游。4.权利要求1所述的GM-CSF和MART-1双基因共表达重组载体的制备方法，包括以下步骤: O获得含有特异性酶切位点的GM-CSF基因片段或MART-1基因片段； 2)将步骤I)得到的GM-CSF基因片段或MART-1基因片段连接于载体，构建含有GM-CSF基因或MART-1基因的重组载体； 3)获得含有酶切粘性末端的MART-1基因片段或GM-CSF基因片段； 4)将步骤3)得到的MART-1基因片段或GM-CSF基因片段连接于步骤2)得到的重组载体，构建所述的GM-CSF和MART-1双基因共表达重组载体。5.权利要求2所述的GM-CSF和MART-1双基因共表达重组载体的制备方法，包括以下步骤: A)获得含有特异性酶切位点的GM-CSF基因片段:从CIK细胞获取cDNA作为模板，用含有EcoR I和BamH I酶切位点序列的GM-CSF特异性引物进行PCR扩增，得到含有EcoR I和BamH I酶切位点的GM-CSF基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:6所示； B)构建pIRES2-GM-CSF-EGFP重组载体:用限制性内切酶EcoRI、BamH I分别酶切PIRES2-EGFP质粒以及步骤A)得到的GM-CSF基因片段，并采用T4DNA连接酶进行连接反应，得到PIRES2-GM-CSF-EGFP重组载体； C)获得含有酶切粘性末端的MART-1基因片段:从黑色素瘤细胞A375获取cDNA作为模板，用含有BstX I和Not I酶切粘性末端的MART-1特异性引物进行PCR扩增，所得到的PCR反应产物再进行杂交PCR反应，得到MART-1基因片段混合物，其中的一种MART-1基因片段具有BstX I和Not I酶切粘性末端； D)构建pIRES2-GM-CSF-MART-l重组载体:用限制性内切酶BstX1、Not I酶切步骤B)得到的pIRES2-GM-CSF-EGFP重组载体，将步骤C)得到的MART-1基因片段混合物与酶切后线性化的PIRES2-GM-CSF-EGFP重组载体混合，采用T4DNA连接酶进行连接反应，得到PIRES2-GM-CSF-MART-1 重组载体。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤A)所述的GM-CSF特异性引物为: GM-CSF 上游引物:5’ -CGGAATTCATGTGGCTGCAGA-3’，GM-CSF 下游引物:5’ -TTGGATCCTCACTCCTGGACT...

【专利技术属性】
技术研发人员：左百乐，曹毓琳，栗炳南，林俊堂，丰慧根，连杰，
申请(专利权)人：河南省华隆生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：