用作治疗剂的可溶性蛋白制造技术

本发明专利技术涉及用作药物的、特别地用于预防或治疗自身免疫病和炎性疾病例如过敏性哮喘和炎性肠病的改进的结合蛋白。本发明专利技术更具体地涉及包含两个异源二聚体的复合物的可溶性蛋白，其中每个异源二聚体基本上由以下组成：(i)第一单链多肽，其包含：(a)具有VH区、CH1区、CH2区和CH3区的抗体重链序列；和(b)与VH区融合的哺乳动物结合分子的单价区域；和(ii)第二单链多肽，其包含：(c)具有VL区和CL区的抗体轻链序列；和(d)与VL区融合的哺乳动物结合分子的单价区域；特征在于每对VH和VL?CDR序列具有针对抗原的特异性，从而所述可溶性蛋白的总价态是六。本发明专利技术还涉及如图1所示的可溶性结合SIRPα的抗体样蛋白。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用作治疗剂的可溶性蛋白本专利技术涉及用作药物的、特别地用于预防或治疗自身免疫病和炎性疾病(例如过敏性哮喘和炎性肠病)的可溶解性、多特异性、多价结合蛋白。本专利技术的可溶性蛋白包含两个异源二聚体的复合物，其中每个异源二聚体基本上由以下组成:(i)第一单链多肽，其包含:(a)具有VH区、CHl区、CH2区和CH3区的抗体重链序列；和(b)与VH区融合的哺乳动物结合分子的单价区域；和(ii)第二单链多肽，其包含:(c)具有VL区和CL区的抗体轻链序列；和(d)与VL区融合的哺乳动物结合分子的单价区域；特征在于每对VH和VL CDR序列具有针对抗原的特异性，从而所述可溶性蛋白的总价态是六。本专利技术更具体地涉及对SIRPa具有特异性的可溶性结合蛋白。本专利技术的一个具体实施方案进一步由图1所示说明。SIRPa (CD172 a )是由包括巨噬细胞、粒细胞和常规树状细胞(DC)的髓系细胞表达以及在神经元细胞上的免疫受体(van den Berg等人，2008, Trends inImmunol.，29(5):203-6)。SIRPa 是 CD47 的低亲和力配体(Rebres 等人，2001，J.Biol.Chem.;276(37):34607-16 ;Hatherley 等人，2007 J.Biol.Chem.;282 (19):14567-75 ;Hatherley 等人，2008 ；Mol.Cell ;31 (2) 266-77)，并且 SIRPa 与 CD47 的相互作用组成了基于黏附和双向信号传导控制的细胞通讯体系，所述细胞通讯体系调节免疫系统和神经元系统中的多种细胞功能。这些功能包括移行、细胞成熟、巨噬细吞噬噬和髓样树状细胞的细胞因子产生(van den Berg 等人，2008Trends in Immunol.29 (5): 203-6 ;Sarfati2009, Current Drug Targets, 9(10):852-50)。来自动物模型的数据表明SIRPa /⑶47相互作用可以有助于或甚至控制几种病症的发病机理，所述病症包括自身免疫病、炎性疾病(Okuzawa等人,2008, BBRC ；371 (3):561-6 ；Tomizawa 等人，2007，J.1mmunol ; 179 (2):869-877)；局部缺血性疾病(Isenberg 等人，2008，Arter.Thromb Vase.Biol., 28 (4):615-21 ；Isenberg2008, Am.J.Pathol., 173(4):1100-12)或肿瘤学相关疾病(Chan 等人,2009, PNAS, 106(33):14016-14021 ；Majeti 等人,2009, Cell, 138(2): 286-99)。调节SIRPa /⑶47途径因此可以是用于多种疾病的有希望的治疗性选项。已经建议使用针对⑶47、SIRP α或⑶47衍生的结合SIRP α的多肽的抗体作为治疗手段(例如见 W01998/40940、W02004/108923、W02007/133811 和 W02009/046541)。此外，结合SIRP α的CD47衍生的融合蛋白在疾病(如TNBS-结肠炎(Fortin等人，2009，JExp Med.，206(9): 1995-2011)、朗格汉斯细胞移行(J.1mmunol.2004，172:4091-4099)和关节炎(VlST Inc, 2008, Exp.0pin.Therap.Pat., 18 (5): 555-561))的动物模型中是有效的。此外，提出 SIRP a/CD47 参与控制吞曬(van den Berg 等人，2008，Trends inImmunol.，29(5):203-6)，并且声称通过SIRP α结合多肽进行干涉来增进NOD小鼠系中的人干细胞植入(W02009/046541)，表明含有CD47胞外结构域(ECD)的治疗剂用于人干细胞移植中的潜在益处。 本专利技术提供了可溶性结合蛋白，它们包含第一和第二多肽链的异源二聚体，每种链包含与抗体重链或轻链序列融合的结合部分。所述可溶性蛋白可以对抗原、靶或结合配偶体具有单、双、三或四特异性，并且与现有技术的分子相比具有增加的价态。与现有技术的分子相比，本专利技术的可溶性蛋白具有提供增加数量的针对结合配偶体的特异性和增加的价态。这具有重要的优点，如下文所述。这些可溶性蛋白用作治疗剂。本专利技术还提供用作治疗剂的改进的可溶性SIRPa结合蛋白。与现有技术的⑶47蛋白融合物相比，如本专利技术中所定义的结合SIRPa的抗体样蛋白可以提供增加针对靶向的表达SIRPa的细胞的亲合力，同时维持优异的可发展性特征的手段。另外，不受任何理论约束，预期较高的亲合力导致较长的药物动力学半寿期，从而提供增强的治疗功效。这些新的研究结果提供了靶向表达SIRPa的细胞的新治疗工具并且代表治疗性前景，特别地对于多种自身免疫病和炎性疾病、癌症或干细胞移植而言是如此。因此，在一个方面，本专利技术提供一种可溶性蛋白，它包含两个异源二聚体的复合物，其中每个异源二聚体基本上由以下组成:⑴第一单链多肽，其包含:(a)具有VH区、CHl区、CH2区和CH3区的抗体重链序列；和(b)与VH区融合的哺乳动物结合分子的单价区域；和(ii)第二单链多肽，其包含:(c)具有VL区和CL区的抗体轻链序列；和(d)与VL区融合的哺乳动物结合分子的单价区域；特征在于每对VH和VL CDR序列具有针对抗原的特异性，从而所述可溶性蛋白的总价态是六。 申请人:先前已经开发了抗体样分子，称作“Fusobodies”，其中抗体的两条臂的可变区由哺乳动物结合分子的区域，例如SIRPa结合结构域替换，从而提供多价可溶性蛋白。本专利技术的可溶性蛋白与 申请人:的Fusobodies相似，因为这些分子也包含抗体序列。但是就本专利技术的分子而言，抗体序列的VH区和VL区一以及相关价态和抗原特异性一已经保留，这些区域与哺乳动物结合分子的区域融合。本专利技术的分子因此具有由双价抗体序列提供的一种或多种结合特异性，和由哺乳动物结合分子的4个单价区域提供的其他特异性。为区分本专利技术的可溶性蛋白与 申请人:先前开发的那些蛋白，术语“延伸型Fusobody”将在下文中使用。 申请人:先前开发的分子将继续称作“Fusobodies”或“非延伸型Fusobodies”。在图1中显示延伸型Fusobody的一个实例，该图也描述了 申请人:先前开发的Fusobody,以及参照Q)47-Fc分子。与现有技术的分子相比，本专利技术的可溶性蛋白具有增加的价态。基于每条多肽链的单价以及每对VH和VL区还提供了单价的抗原结合特异性，本专利技术的异源二聚体优选地具有三价态。本专利技术的可溶性蛋白因此基于由4条多肽链上的哺乳动物结合分子的区域贡献的四价和由抗体VH区和VL区贡献的二价，具有六价态(六价)。在优选的实施方案中，每一单链多肽是单价的，每一异源二聚体是三价的，并且每一可溶性蛋白(基于两个异源二聚体的复合物)是六价的。通过在每种第一和第二单链多肽中并入单价的结合分子和由每对VH区和VL区提供的单价抗原结合特异性，每个异源二聚体的价态是三价，即，每个异源二聚体可本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可溶性蛋白，其包含两个异源二聚体的复合物，其中每个异源二聚体基本上由以下组成：(i)第一单链多肽，其包含：(a)具有VH区、CH1区、CH2区和CH3区的抗体重链序列；和(b)与VH区融合的哺乳动物结合分子的单价区域；和(ii)第二单链多肽，其包含：(c)具有VL区和CL区的抗体轻链序列；和(d)与VL区融合的哺乳动物结合分子的单价区域；特征在于每对VH和VL?CDR序列具有针对抗原的特异性，从而所述可溶性蛋白的总价态是六。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.06.16 US 61/497,668;2012.04.18 US 61/625,7131.一种可溶性蛋白，其包含两个异源二聚体的复合物，其中每个异源二聚体基本上由以下组成: (i)第一单链多肽，其包含: (a)具有VH区、CHl区、CH2区和CH3区的抗体重链序列；和 (b)与VH区融合的哺乳动物结合分子的单价区域； 和 (?)第二单链多肽，其包含: (c)具有VL区 和CL区的抗体轻链序列；和 (d)与VL区融合的哺乳动物结合分子的单价区域；特征在于每对VH和VLCDR序列具有针对抗原的特异性，从而所述可溶性蛋白的总价态是六。2.根据权利要求1所述的可溶性蛋白，其中蛋白质针对1、2或3种结合配偶体具有结合特异性。3.根据权利要求1或权利要求2所述的可溶性蛋白，其中包含于所述第一和第二单链多肽内部的哺乳动物结合分子的区域是相同的。4.根据权利要求1至3中任一项所述的可溶性蛋白，其中哺乳动物结合分子的每个单价区域和每对VH和VL CDR序列对相同的单一抗原具有结合特异性。5.根据权利要求1至3中任一项所述的可溶性蛋白，其中哺乳动物结合分子的区域能结合抗原上的第一表位，并且每对VH和VL⑶R序列能结合相同抗原上的第二表位。6.根据权利要求1至3中任一项所述的可溶性蛋白，其中哺乳动物结合分子的区域和每对VH和VL CDR序列能结合相同抗原上的相同表位。7.根据权利要求1至3中任一项所述的可溶性蛋白，所述蛋白质对两种抗原具有结合特异性，其中哺乳动物结合分子的每个区域对第一抗原具有结合特异性，并且每对VH和VLCDR序列对第二抗原具有结合特异性。8.根据权利要求1或权利要求2所述的可溶性蛋白，其中包含于所述第一和第二单链多肽内部的哺乳动物结合分子是不同的。9.根据权利要求8所述的可溶性蛋白，所述蛋白质对两种抗原具有结合特异性，其中包含于第一单链多肽内部的哺乳动物结合分子的区域对第一抗原具有结合特异性，并且包含于第二单链多肽内部的哺乳动物结合分子的区域对第二抗原具有结合特异性，并且每对VH和VL⑶R序列对第一抗原或第二抗原具有结合特异性。10.根据权利要求1至3中任一项所述的可溶性蛋白，所述蛋白质对三种抗原具有结合特异性，其中包含于第一单链多肽内部的哺乳动物结合分子的区域对第一抗原具有结合特异性，包含于第二单链多肽内部的哺乳动物结合分子的区域对第二抗原具有结合特异性，并且每对VH和VL CDR序列对第三抗原具有结合特异性。11.根据任一前述权利要求所述的可溶性蛋白，其中所述哺乳动物结合分子是蛋白质、细胞因子、生长因子、激素、信号传导蛋白、炎性介质、低分子量化合物、配体、细胞表面受体、或其片段。12.根据权利要求11所述的可溶性蛋白，其中所述哺乳动物结合分子是单体的或同聚的细胞表面受体的胞外结构域。13.根据权利要求12所述的可溶性蛋白，其中所述哺乳动物单体的或同聚的细胞表面受体包含IgSF结构域。14.根据权利要求12或权利要求13所述的可溶性蛋白，其中所述哺乳动物结合分子包含SIRPa结合结构域。15.根据权利要求14所述的可溶性蛋白，其中所述SIRPa结合结构域选自: (i)人细胞表面受体CD47的胞外结构域； (ii)SEQID NO:2的衍生的胞外结构域；(iii)SEQID NO: 3,SEQ ID NO: 4,SEQ ID NO: 5,SEQ ID NO: 57 的多肽或其保留 SIRP a结合特性的片段；和，(iv)SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4，SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 57 的或所述片段的变体多肽，所述变体多肽具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99%序列同一性并保留SIRP a结合特性。16.根据权利要求14或权利要求15所述的可溶性蛋白，其中包含于所述第一和第二单链多肽内部的两个或多个SIRP a结合结构域彼此共有至少60、70、80、90、95、96、97、98、99或99.5%序列同一性百分数。17.根据权利要求14至16中任一项所述的可溶性蛋白，其中两个或多个SIRPa结合结构域具有相同的氨基酸序列。18.如权利要求14至17中任一项所述的可溶性蛋白，其中每个异源二聚体内部的SIRPa结合结构域具有相同的氨基酸序列。19.根据权利要求14至18中任一项所述的可溶性蛋白，其中SIRPa结合结构域是具有选自SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID N0:5和SEQ IDNO:57的氨基酸序列的人细胞表面受体CD47的胞外结构域。20.根据权利要求15所述的可溶性蛋白，其包含两个异源二聚体的复合物，其中每个异源二聚体基本上由以下组成: α)第一单链多肽，其包含: (a)具有VH区、CHl区、CH2区和CH3区的抗体重链序列；和 (b)CD47的胞外结构域的单价区域，所述CD47区域的羧基端与VH区的N末端融合；和 (?)第二单链多肽，其包含: (c)具有VL区和CL区的抗体轻链序列；和 (d)CD47的胞外结构域的单价区域，所述CD47区域的羧基端与VL区的N末端融合。21.根据权利要求20所述的可溶性蛋白，其中CD47的胞外结构域的所述区域是SEQIDNO:3 或 SEQ ID NO:57。22.根据任一前述权利要求所述的可溶性蛋白，其中VH和VLCDR序列对TNF α、环孢菌素A或衍生自它们...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·胡贝尔，F·科尔宾格，K·韦尔岑巴赫，
申请(专利权)人：诺瓦提斯公司，
类型：
国别省市：