使用热移位测定用于鉴定指示药物应答减少的生物标记物的方法技术

本发明专利技术涉及用于鉴定和使用生物标记物的方法或者生成蛋白质组谱的方法，所述生物标记物和蛋白质组谱指示患者中对药物的应答减少，所述方法涉及对样品的热移位测定。所述方法包括下述步骤：a)加热来自患者的样品，b)使可溶性蛋白质与不溶性蛋白质分开，和c)分析步骤b)的可溶性级分和不溶性级分中任一或两者，以测定熔融温度。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及特别是通过使用热移位分析，研究蛋白质的生物化学活化状态的方法，以及用于鉴定与减少的药物应答相关的候选生物标记物的方法。
技术介绍
更特别地，本专利技术涉及用于鉴定指示对药物的应答减少的生物标记物的方法，所述方法包括下述步骤：加热来自用药物治疗且响应药物的患者的样品，以及来自用药物治疗但对药物具有减少的应答的患者的样品，分析产物以测定每种样品中的至少一种蛋白质的熔融温度，并且鉴定与来自具有减少的药物应答的患者的样品相比较，在来自药物应答患者的样品中具有不同熔融温度的至少一种蛋白质。特别地，所鉴定的至少一种蛋白质不同于药物的靶蛋白质。该方法还可用于产生代表用于调查其他患者中的药物抗性发展的指纹的数据集。此外，可进行细胞分辨方法，其中可进行在加热样品后的细胞分选步骤，以允许特定细胞类型的分析。癌症是日益严重的全球和国家之谜，并且不断增长的发病率及死亡率是许多国家包括瑞典渐增的问题。目前的每年全球癌症发病率为约12,700,000，并且估计在2030年超过20,000,000。可悲的是，治疗策略中的改善相对是有限的。大部分的目前癌症疗法仍取决于常规、广泛细胞毒性的药物，而更癌症特异性的靶向疗法相对近期已加入治疗库中，具有不同的成功。同时，在分子、细胞和生理学水平上剖析癌症过程的全球研究团体已取得很大进展(Hanahan和Weinberg,Cell 2011 144；646)。值得注意的是，允许快速分析患者癌症基因组的下一代测序技术已生成不同癌症中的驱动突变的综合作图，并且目前用于理解在基因组水平上的肿瘤异质性和药物抗性发展(Vogelstein,Science 2013 339；1546)。基于越来越多的基础癌症生物学的知识，大量新型肿瘤学药物靶目前用于开发靶向药物。在与其他药物的正确组合中，并且伴随为了治疗功效的适当伴侣生物标记物/诊断学的使用，此类替代方案已提出癌症疗法中的突破的希望。存在成功靶向药物的少数值得注意的例子，例如黑素瘤中的BRAF抑制剂、慢性髓样淋巴瘤中的BCR-Abl抑制剂、以及针对PD-1的单克隆抗体(Fridlyand,Nat Rev Drug Discov 2013 12；743)。然而，新型肿瘤学药物的大多数临床试验是令人失望的，强调了挑战的严重性(Verma,Oncologist 2011 16；25，Amiri-Kordestani,J Natl Cancer Inst2012 104；568)。关于这点的潜在原因是癌症进展的固有特性、在肿瘤内和不同患者之间的大克隆异质性、以及在治疗期间的药物抗性的快速进化(Solyanik Exp Oncol 2010 32；181)。然而，癌细胞的突变或克隆签名仅是故事的一部分(Niepel Curr Opin Chem Biol 2009 13；556)。例如，表观遗传及其他细胞变化可在细胞分裂后转移。重要的是，肿瘤中的癌细胞高度依赖于微环境且与微环境相互作用，所述微环境在很大程度上是异质的。与邻近细胞包括基质细胞和免疫系统的细胞的串扰直接影响癌细胞中的调节和代谢过程。类似地，肿瘤中的血管的形貌和穿透将调节氧和营养素包括能量和必需代谢产物的可用性，其随后还影响癌细胞中的调节和代谢过程(Swartz,Cancer Res2012 72；2473)。局部串扰以及对氧和营养素的接近因此基础地影响癌细胞中的生物化学过程。变得越来越明确的是这些生物化学过程的状态以及药物可调节其的程度是癌症药物功效的关键决定因素。同样重要的是，在肿瘤微环境和癌细胞生物化学中的差异基础地改变药物到达预期的靶蛋白质的能力(Olive,Science 2009 324；1457，Niepel,Science Signaling2013 6；294)。然而，在肿瘤环境内的生物化学过程和药物作用难以用目前技术接近。因此，生成用于监控药物作用包括抗性发展的生物化学生物标记物的改善策略对于未来开发改善的癌症疗法将是关键的。令人惊讶的是，本专利技术人已开发基于热移位测定的方法，所述方法可用于鉴定与患者中的药物抗性相关的候选生物化学生物标记物。因此，该方法可用于鉴定在来自药物应答患者和药物非应答患者的样品中，在不同温度下熔融的蛋白质，所述患者已用药物进行治疗。此类蛋白质代表候选生物化学生物标记物，其在响应和非响应患者样品中可具有不同的活化状态。虽然热移位测定先前据报道鉴定配体(例如药物)与靶蛋白质的结合，但先前未认识到此类测定可用于调查样品中的其他蛋白质的状态(例如活化状态)，并且此类测定因此可用于鉴定关于药物抗性的生物标记物。本专利技术人已发现特定热移位测定的使用允许监控不同蛋白质的活化状态中的生物化学变化。蛋白质具有少数不同的生物化学状态，并且本专利技术人已显示能够使用特异性热移位测定区分活化状态。活化状态的区分允许鉴定在药物响应样品和药物非响应样品中具有不同状态的蛋白质。此类蛋白质代表关于药物抗性的候选生物标记物。本专利技术人因此已开发了可应用于蛋白质组水平以发现与药物抗性相关的新型生物标记物的测定。有利地，新方法可直接对得自患者的样品进行，其允许方法的热步骤在需要时在从患者获得样品的3分钟内执行。该方法因此可允许准确评价样品的生物化学且鉴定关于药物非应答性的候选生物标记物。
技术实现思路
在第一个方面，本专利技术提供了用于鉴定指示患者中对药物的应答减少的生物标记物的方法，所述方法包括下述步骤：a)加热来自用药物治疗且响应药物的患者的样品，b)使步骤a)的产物中的可溶性蛋白质与不溶性蛋白质分开，c)分析步骤b)的可溶性蛋白质级分和不溶性蛋白质级分中任一或两者，d)用来自用药物治疗的患者的样品重复步骤a)至c)，其中所述患者对药物具有减少的应答，和e)鉴定与来自药物非应答患者的样品相比较，在来自药物应答患者的样品中具有不同熔融温度的至少一种蛋白质，其中所述蛋白质是指示对药物的应答减少的生物标记物。该方法的分析步骤c)优选测定一种或多种蛋白质的熔融温度。任选地，步骤d)可与步骤a)至c)同时或在步骤a)至c)之前执行。当步骤d)在步骤a)至c)之前或在步骤a)至c)之后执行时，执行步骤之间的时间段可为任何时间段，例如几分钟(例如1-10分钟)、几小时(例如1、2、5、10小时)、几个月(1、2、5、10个月)或几年(1、2、3、4或5年)。样品因此可在不同时间获得且处理，并且同时或直接序贯加工是不必要的(尽管可这样完成)。特别地，应了解在其中样品得自相同患者的情况下，例如，当他们是药物应答的时，并且当他们发展减少的药物应答时，显著时间段可在不同样品的收集和/或加工(例如加热、分开和/或分析)之间发生(例如如上所述的几个月或几年)。在另一个方面，在药物治疗之前或不含药物治疗，来自已知响应药物的患者的样品可用于本专利技术的方法中是可能的。类似地，在药物治疗之前或不含药物治疗，来自已知具有减少的药物应答的患者的样品可用于本专利技术的方法中。尽管不受理论束缚，但认为对药物的一些应答可硬连线到细胞内，即使在不存在对药物自身的暴露的情况下。因此，可能能够仅通过比较来自已知为药物应答的患者和来自已知具有减少的药物应答的患者的结果，鉴定关于药物应答减少的生物标记物。因此，在这个方面，本专利技术可提供用于鉴本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于鉴定指示患者中对药物的应答减少的生物标记物的方法，所述方法包括下述步骤：a)加热i)来自对所述药物具有减少的应答的患者的样品，或ii)来自响应所述药物的患者的样品；b)使i)或ii)的可溶性蛋白质与不溶性蛋白质分开；和c)分析步骤b)的所述可溶性级分和不溶性级分中任一或两者，并且当i)在步骤a)和b)中被加热且分开时，与得自使来自响应所述药物的患者的样品加热且分开的相应级分相比较，或当ii)在步骤a)和b)中被加热且分开时，与得自使来自对所述药物具有减少的应答的患者的样品加热且分开的相应级分相比较，以鉴定与来自所述药物应答患者的所述样品相比较，在来自药物应答减少的样品的所述样品中具有不同熔融温度的至少一种蛋白质。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.03.25 GB 1405327.61.一种用于鉴定指示患者中对药物的应答减少的生物标记物的方法，所述方法包括下述步骤：a)加热i)来自对所述药物具有减少的应答的患者的样品，或ii)来自响应所述药物的患者的样品；b)使i)或ii)的可溶性蛋白质与不溶性蛋白质分开；和c)分析步骤b)的所述可溶性级分和不溶性级分中任一或两者，并且当i)在步骤a)和b)中被加热且分开时，与得自使来自响应所述药物的患者的样品加热且分开的相应级分相比较，或当ii)在步骤a)和b)中被加热且分开时，与得自使来自对所述药物具有减少的应答的患者的样品加热且分开的相应级分相比较，以鉴定与来自所述药物应答患者的所述样品相比较，在来自药物应答减少的样品的所述样品中具有不同熔融温度的至少一种蛋白质。2.一种用于鉴定指示患者中对药物的应答减少的生物标记物的方法，所述方法包括下述步骤：a)加热来自响应所述药物的患者的样品，b)使步骤a)的产物中的可溶性蛋白质与不溶性蛋白质分开，c)分析步骤b)的可溶性蛋白质级分和不溶性蛋白质级分中任一或两者，d)用来自对药物具有减少的应答的患者的样品重复步骤a)至c)，和e)鉴定与来自所述药物应答减少的患者的所述样品相比较，在来自所述药物应答患者的所述样品中具有不同熔融温度的至少一种蛋白质，其中所述蛋白质是指示对所述药物的应答减少的生物标记物，其中步骤d)任选地在步骤a)至c)之前或与步骤a)至c)同时进行。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述患者已用所述药物进行治疗。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中步骤c)测定一种或多种蛋白质的熔融温度。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中步骤b)的所述可溶性级分或不溶性级分通过质谱法进行分析。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中关于所述药物的靶蛋白质从鉴定步骤e)中排除。7.一种用于生成来自样品的蛋白质组谱的方法，所述蛋白质组谱指示患者中减少的对药物的应答，所述方法包括下述步骤：a)加热来自响应所述药物的患者的样品，b)使可溶性蛋白质与不溶性蛋白质分开，c)分析步骤b)的所述可溶性蛋白质级分和不溶性蛋白质级分中任一或两者，以测定多种蛋白质的熔融温度，d)用来自对所述药物具有减少的应答的患者的样品重复步骤a)至c)，和e)对于所述多种蛋白质产生蛋白质组谱，所述蛋白质组谱指示在对于来自响应所述药物的患者的样品的蛋白质获得的解链温度和对于来自对所述药物具有减少的应答的患者的样品的蛋白质获得的解链温度之间的定量差异，其中任选地，步骤d)可在步骤a)至c)之前或与步骤a)至c)同时执行。8.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：丹尼尔·马丁内斯·莫利纳，帕尔·诺尔德伦，
申请(专利权)人：佩拉戈生物科学公司，
类型：发明
国别省市：瑞典;SE