用于从微藻生物质提取可溶性蛋白的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于从小球藻属微藻生物质制备分离蛋白的方法，其特征在于它包括以下步骤：供给一种由发酵产生的微藻生物质；任选地，洗涤该生物质，以便消除可溶性间质化合物，在50℃和150℃之间，优选在100℃和150℃之间的温度下将该生物质热透化，持续时间在10秒和5分钟之间，优选持续时间在10秒和1分钟之间；将以此方式透化的生物质借助选自下组的固液分离技术进行消除，该组由以下各项组成：正向过滤或切向过滤、絮凝和离心，更确切地，多级离心，以获得一种可溶性部分；任选地，将由此获得的可溶性部分通过微孔过滤进行回收和澄清，以便从中除去残余不溶性元素；在具有小于5kDa，优选在1kDa和5kDa之间的截止阈值的膜上对该可溶性部分进行超滤，以产生一种可溶性分离蛋白；然后将所述分离蛋白蒸发、巴氏灭菌并雾化。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及一种用于从微藻生物质提取可溶性蛋白的方法。本专利技术还涉及以此方式获得的微藻分离蛋白。
技术介绍
所属领域技术人员熟知，小球藻是一种潜在的食物来源，因为它们富含蛋白质和其他必需营养素。它们被描述为包含45％的蛋白质、20％的脂肪、20％的碳水化合物、5％的纤维素和10％的矿物质和维生素。鉴于其丰度和氨基酸谱，微藻蛋白因此被认为是大豆蛋白或豌豆蛋白的替代性食物来源。蛋白部分也可以被开发为化妆品行业、或甚至医药行业中的功能剂。然而，由于在所述部分中存在不希望的化合物(例如叶绿素)而导致包含它们的食物组合物的颜色、味道和结构方面发生不希望的变化，所以在微藻蛋白的食品应用方面的发展尚不显著。为了增加其在食品应用中的潜力，并且也为了增加其商业价值，因此必须在不影响它们的分子结构的前提下从微藻中提取这些蛋白。“软”提取技术将因此需要分离具有高溶解度和良好技术和功能特性的蛋白质，但是微藻细胞壁的刚性，尤其绿色微藻的刚性，根本上与这一点矛盾，这是因为它破坏了细胞内蛋白质的提取和完整性。因此，与其相反，常规地“硬”的物理或化学条件被用来破坏微藻细胞壁。因此，许多研究提出了碱溶类型、通过有机溶剂型或高压匀浆类型提取的技术。然而，在这些技术选择中，蛋白质的变性未认为是麻烦的，这是因为大多数的这些方法开发，是出于分析的目的，或意在提供用于酶消化的底物，从而产生水解蛋白。然而，保存细胞组分完整性的有效崩解方法具有不仅最大化产率，而且最大化提取的产物的质量的责任。换言之，用于优化崩解壁的方法必须例如避免：-目标产物的化学污染，-使用过高的破裂能；后者可能导致感兴趣的细胞内分子的不可逆变性或降解。此外，对于大规模生产而言，对于选择的方法，重要的是可转换值这一规模。最后，这一细胞崩解步骤的引入必须是容易的，并且必须对随后的方法/处理步骤不具有负面影响。所有这些限制影响崩解方法的效率并且由于同样原因影响其能量消耗。这就是为什么珠磨机技术是优选的，因为它被认为对于按其天然形式释放细胞内蛋白质是有效的。在珠磨机中，将细胞与小球形颗粒一起以悬浮液状态搅动。细胞的破碎是由珠间剪切力、碾磨以及与珠的碰撞引起的。例如，专利US5330913中给出了一种适合的珠磨机的描述。这些珠使细胞破裂以从中释放细胞内容物。然后以“水包油”乳液形式获得粒径小于起源细胞的悬浮液。通常雾化此乳液并且消除水，然而留下包含由细胞碎片、间质可溶性化合物和油组成的异质混合物的干燥粉末。在使用这些细胞崩解技术时难以解决的是单独地分离细胞内内容物(以便排除膜碎片、糖、纤维和脂肪)，并且尤其是保存蛋白负载的质量。在四爿藻属的微藻的情况下，安雅施文茨法伊尔(AnjaSchwenzfeier)等人(生物资源技术(BioresourceTechnology)，2011，102，9121-9127)提出了保证分离蛋白质的溶解度和氨基酸谱质量的方法，其中污染物(例如染色物质)被除去，该方法包括以下步骤：-用珠磨机进行细胞崩解，-将磨碎的微藻悬浮液离心，-上清液的透析，-穿过离子交换树脂，-洗脱物的透析，-脱色，然后-洗涤和再悬浮。然而，这种实验室方法(用于处理24g的生物质)不能放大到工业规模，其中而将珠磨机方法用于回收完整生物质。已经提出了替代解决方案，完全地改变了用于释放微藻细胞内容物的技术，例如脉冲场电处理。这是因为生物细胞暴露于高强度脉冲电场会改变细胞膜的结构。外源场引起细胞膜的充电。在充足的跨膜电压(0.5V-1V)下，磷脂的分子排列改变，这导致细胞膜失去其屏障作用，使得它可渗透。取决于使用的条件，这一细胞膜透化会是可逆的或不可逆的。然而，为了有效提取细胞内化合物，本领域普通技术人员建议造成细胞膜的不可逆的透化，由此导致其崩解。然后，细胞膜的这一破裂促进释放细胞内容物的释放，并且在使用补充性溶剂提取技术的情况下，也促进溶剂渗透进入细胞。尽管是有前景的，但是不幸地，这一技术并不能外推至工业规模以处理在1m3至200m3的反应器中产生的生物质。其结果是，对于提供用于弱化微藻细胞壁的技术仍存在未满足的需求，该技术能够释放细胞内内容物，而不崩解细胞或削弱其组分的质量。本申请人公司已经发现，这种需要可以通过将用于微藻细胞的热透化的方法与离心和膜分离(微孔过滤，超滤)的步骤加以组合得到满足。因此，本申请人公司反对一个技术偏见，该技术偏见认为，用于细胞破碎的热方法，就像由机械崩解引起的剪切力，是用于降解或变性源自微藻的产物的替代的技术(里奇蒙(Richmond)，1986，微藻大量培养手册(HandbookofMicroalgalMassCulture)，CRC出版有限公司(CRCPress,Inc)-莫利纳格里马(MolinaGrima)等人，2003，微藻生物质和代谢物的回收：方法选项和经济学(Recoveryofmicroalgalbiomassandmetabolites:processoptionsandeconomics)，生物技术进步(Biotechnol.Adv.)20:491-515)。此外，一旦释放自细胞内区室，可以容易地通过离心和膜分离进行分子的回收，只要由本申请人公司开发的热处理并不导致细胞壁的崩解。本专利技术涉及一种用于热透化小球藻属微藻生物质的方法，该方法以从微藻生物质中回收尤其富含肽和多肽并且富含寡糖的可溶性部分的方式进行。更确切地，根据本专利技术所述的方法是一种用于从小球藻属微藻生物质制备分离蛋白的方法，该方法包括以下步骤：-提供一种由发酵产生的微藻生物质，-任选地，洗涤该生物质，以便消除间质可溶性化合物，-在50℃和150℃之间，优选在100℃和150℃之间的温度下将该生物质热透化，持续时间在10秒和5分钟之间，优选持续时间在10秒和1分钟之间，-将以此方式透化的生物质通过选自下组的固液分离技术进行消除，该组由以下各项组成：正向过滤或切向过滤、絮凝和离心，更具体地，多级离心，以获得可溶性部分，-任选地，将以此方式获得的可溶性部分通过微孔过滤进行回收和澄清，以便从中除去残余不溶性物质，-在具有小于5kDa，优选在1kDa和5kDa之间的截止阈值的膜上对该可溶性部分(澄清的或未澄清的，取决于是否分别进行了前述回收和澄清的步骤)进行超滤，以便获得可溶性分离蛋白，然后-将所述分离蛋白蒸发、巴氏灭菌并雾化。微藻的选择优选地，小球藻属微藻选自由普通小球藻、根腐小球藻和原壳小球藻组成的组，并且更具体地是原壳小球藻。在一个具体实施例中，该菌株为原壳小球藻(菌株UTEX250-美国得克萨斯大学奥斯汀分校藻类培养物保藏中心(TheCultureCollectionofAlgaeattheUniversityofTexasatAustin-USA))。在另一个具体实施例中，该菌株为耐热性小球藻(菌株UTEX1663-美国得克萨斯大学奥斯汀分校藻类培养物保藏中心(TheCultureCollectionofAlgaeattheUniversityofTexasatAustin-USA))。在异养条件下并且在不存在光的情况下进行培养通常导致产生具有按干细胞的重量计，45％至70％的蛋白含量(通过测量氮含量N×6.25进行评估)的小球藻生物质。如将在下文示例，分两个步骤进行这本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于从小球藻属微藻生物质制备分离蛋白的方法，其特征在于它包括以下步骤：‑提供一种由发酵产生的微藻生物质，‑任选地，洗涤该生物质，以便消除间质可溶性化合物，‑在50℃和150℃之间，优选在100℃和150℃之间的温度下将该生物质热透化，持续时间在10秒和5分钟之间，优选持续时间在10秒和1分钟之间，‑将以此方式透化的生物质通过选自下组的固液分离技术进行消除，该组由以下各项组成：正向过滤或切向过滤、絮凝和离心，更具体地，多级离心，以获得一种可溶性部分，‑任选地，将以此方式获得的可溶性部分通过微孔过滤进行回收和澄清，以便从中除去残余不溶性物质，‑在具有小于5kDa，优选在1kDa和5kDa之间的截止阈值的膜上对该可溶性部分进行超滤，以便获得一种可溶性分离蛋白，然后‑将所述分离蛋白蒸发、巴氏灭菌并雾化。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.07.18 FR 14569441.一种用于从小球藻属微藻生物质制备分离蛋白的方法，其特征在于它包括以下步骤：-提供一种由发酵产生的微藻生物质，-任选地，洗涤该生物质，以便消除间质可溶性化合物，-在50℃和150℃之间，优选在100℃和150℃之间的温度下将该生物质热透化，持续时间在10秒和5分钟之间，优选持续时间在10秒和1分钟之间，-将以此方式透化的生物质通过选自下组的固液分离技术进行消除，该组由以下各...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·帕蒂尼尔，
申请(专利权)人：罗盖特公司，
类型：发明
国别省市：法国;FR