一种烟叶中FⅠ叶蛋白提取和分离纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种烟叶中FⅠ叶蛋白提取和分离纯化方法，所述的烟叶中FⅠ叶蛋白提取和分离纯化方法包括样品采集、FⅠ叶蛋白提取、FⅠ叶蛋白分离、FⅠ叶蛋白纯化、FⅠ叶蛋白结晶步骤。本发明专利技术能够有效提高FⅠ叶蛋白的纯度和回收率，有利于拓展烟叶非烟用途，促进烟叶资源的高效利用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于烟草化学
，具体涉及一种烟叶中FⅠ蛋白提取和分离纯化方法。
技术介绍
随着对叶蛋白研究的不断深入，人们逐渐认识到植物叶蛋白是世界上最丰富的蛋白资源,是解决当前世界人口日益膨胀问题的一个新的食物蛋白来源。特别是在我国人多地少日益突出的情况下，充分利用植物叶片提取可食用的蛋白质更是迫在眉睫，自然界的叶片资源非常丰富，当前最主要用于蛋白质提取的是烟草叶片，由于烟草叶片资源丰富，提取过程简单，易于结晶。我国是世界上烟草产量最大的国家，烟草种植中不可避免地会产生大量低次烟叶，约占年生产烟叶的20%，社会及经济效益受到严重影响。如何充分、合理地利用这些低次烟叶，无疑是一项值得充分研究的课题。而且由于世界性戒烟运动的逐步普及，烟草的传统用途将逐步减少，这将严重冲击烟草的种植和加工业。因此人们对烟草的兴趣，已开始从直接生产卷烟，转向用它生产其它植物用品，如提取FI蛋白等，以作它途。烟草叶片蛋白质含量较高，其在白肋烟中的含量高达20.48%。烟叶中的蛋白质分为可溶性蛋白和不可溶性蛋白。可溶性蛋白中一半左右是叶绿体蛋白质(FractionIprotein,FI蛋白)，另一半为其他可溶性蛋白质的复合物(FractionIIprotein,FII蛋白)。烟草FI蛋白是目前已知的自然界唯一可以被大量结晶的植物Rubisco，其结晶为白色或米白色粉末。而烟草中所含的组分FI可溶性蛋白质，由于其纯净、易于分离、营养价值高而最具开发前景。有研究表明，从烟草中提取的可供食用的蛋白质含有人体所需的全部必需氨基酸，其吸水性、乳化性、发泡性和凝胶性均优于酪蛋白(牛奶的主要蛋白成分)。从营养、医疗和食品角度来评价，烟草蛋白属于优质蛋白。目前，意大利、美国、法国、印度和保加利亚等国正在研究和开发烟草中所含的这种晶态蛋白质。相比之下，我国在这方面的研究工作则报道较少，鉴于此，本研究通过总结国内外前人研究的经验，结合我国的实际情况开发出一套适合大规模投入生产的新方法，实现我国烟草生产中低次烟叶变废为宝，增加农民的收入。以期对我国烟草新用途的研究及开发有所裨益。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种烟叶中FⅠ蛋白提取和分离纯化方法。本专利技术的目的是这样实现的，所述的烟叶中FⅠ叶蛋白提取和分离纯化方法包括样品采集、FⅠ叶蛋白提取、FⅠ叶蛋白分离、FⅠ叶蛋白纯化、FⅠ叶蛋白结晶步骤，具体包括：A、样品采集：采集绿色烟叶，然后避光存放6~24h（不超过24h）直至叶片出现轻度萎蔫备用；B、FⅠ叶蛋白提取：将A步骤得到的烟叶片去掉主脉，置入组织捣碎机中，加入烟叶片重量体积0.1~0.3倍的0.1MNaCl溶液，同时加入烟叶片重量0.04~0.06倍的711阴离子交换树脂，用组织捣碎机磨浆0.5~1.5min得到匀浆液，将匀浆液过滤得到滤液，调节滤液的pH值为7.3~7.6，快速加热滤液至45~55℃，并维持20~40min，然后迅速冷却至20℃，然后转入离心机离心得到离心上清液；C、FⅠ叶蛋白分离：取B步骤的离心上清液，用(NH4)2SO4盐析，取45%～55%盐析出的蛋白质沉淀段得到沉淀a；D、FⅠ叶蛋白纯化：将沉淀a用柱平衡缓冲液溶解得到蛋白初溶液b，将蛋白初溶液b通过经缓冲液平衡过的葡聚糖凝胶G-50柱，以1.5ml/min的流速洗脱，收集第6~7ml的洗脱液即为分离得到的FⅠ叶蛋白溶液；E、FⅠ叶蛋白结晶：向收集的FⅠ叶蛋白溶液中加入等体积的0.025MTris-Cl，pH7.4缓冲液得到稀释后的蛋白流出液，于4℃静置结晶得到FⅠ叶蛋白结晶。本专利技术的有益效果：1、本专利技术能够有效提高FⅠ叶蛋白的提取率，与其它方法相比，具有提取率高的特点；提取方法蛋白种类粗提分离精提提取效率本方法可溶蛋白15.4713.3311.1271.88FI蛋白7.496.505.0769.69透析稀释结晶法可溶蛋白15.2612.5710.1366.38FI蛋白7.335.994.6663.57直接稀释结晶法可溶蛋白15.1912.048.9258.72FI蛋白7.285.634.0855.49双水相萃取法可溶蛋白15.3813.1610.5568.60FI蛋白7.456.324.8765.372、提出烟叶FⅠ叶蛋白纯度高，达到Native-page电泳纯。附图说明图1为本专利技术粗体液中蛋白示意图；图2为本专利技术层析分离液中蛋白示意图。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术作进一步的说明，但不以任何方式对本专利技术加以限制，基于本专利技术教导所作的任何变换或替换，均属于本专利技术的保护范围。本专利技术所述的烟叶中FⅠ叶蛋白提取和分离纯化方法包括样品采集、FⅠ叶蛋白提取、FⅠ叶蛋白分离、FⅠ叶蛋白纯化、FⅠ叶蛋白结晶步骤，具体包括：A、样品采集：采集绿色烟叶，然后避光存放6~24h（不超过24h）直至叶片出现轻度萎蔫备用；B、FⅠ叶蛋白提取：将A步骤得到的烟叶片去掉主脉，置入组织捣碎机中，加入烟叶片重量体积0.1~0.3倍的0.1MNaCl溶液，同时加入烟叶片重量0.04~0.06倍的711阴离子交换树脂，用组织捣碎机磨浆0.5~1.5min得到匀浆液，将匀浆液过滤得到滤液，调节滤液的pH值为7.3~7.6，快速加热滤液至45~55℃，并维持20~40min，然后迅速冷却至20℃，然后转入离心机离心得到离心上清液；C、FⅠ叶蛋白分离：取B步骤的离心上清液，用(NH4)2SO4盐析，取45%～55%盐析出的蛋白质沉淀段得到沉淀a；D、FⅠ叶蛋白纯化：将沉淀a用柱平衡缓冲液溶解得到蛋白初溶液b，将蛋白初溶液b通过经缓冲液平衡过的葡聚糖凝胶G-50柱，以1.5ml/min的流速洗脱，收集第6~7ml的洗脱液即为分离得到的FⅠ叶蛋白溶液；E、FⅠ叶蛋白结晶：向收集的FⅠ叶蛋白溶液中加入等体积的0.025MTris-Cl，pH7.4缓冲液得到稀释后的蛋白流出液，于4℃静置结晶得到FⅠ叶蛋白结晶。A步骤中采集绿色烟叶的时间为晴天上午10：00~12：00。B步骤中所述的过滤是采用四层纱布过滤。B步骤中所述的迅速冷却是于冰浴中迅速冷却。B步骤中所述的离心是于3~5℃条件下以12000rpm的速度离心20min得到离心上清液。D步骤中静置结晶的静置时间为4~6天。下面以具体实施案例对本专利技术做进一步说明：实施例1（1）样品采集：在云南省玉溪市红塔区大营街田间，于晴天上午10：00-10:20采集绿色烟叶，品种为K326，带回室内，立即进行处理。（2）FⅠ叶蛋白提取：将叶片去掉主脉，取500g叶片放入组织捣碎机中，加入100mL0.1MNaCI溶液，加入25克711阴离子交换树脂，用组织捣碎机磨浆1分钟。绿色的匀浆液用四层纱布过滤，调节滤液的pH值到7.4，将滤液搅拌的同时快速加热到50℃，并维持30分钟，然后将悬浮液在冰浴中迅速冷却至20℃。在4℃条件下，以12000rpm速度离心20min。（3）FⅠ叶蛋白分离：取离心后的上清液，用(NH4)2SO4盐析，取45%～55%盐析出的蛋白质段。具体做法：准确量取上清液体积，依25.8g硫酸铵/100mL上清液的比例（即45%饱和硫酸铵）准确称取硫酸铵，在低速搅拌下，少量多次缓慢地加入。加完后，置冰箱中沉静15分钟，以12000转/分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种烟叶中FⅠ叶蛋白提取和分离纯化方法，其特征在于所述的烟叶中FⅠ叶蛋白提取和分离纯化方法包括样品采集、FⅠ叶蛋白提取、FⅠ叶蛋白分离、FⅠ叶蛋白纯化、FⅠ叶蛋白结晶步骤，具体包括：A、样品采集：采集绿色烟叶，然后避光存放6~24h备用；B、FⅠ叶蛋白提取：将A步骤得到的烟叶片去掉主脉，置入组织捣碎机中，加入烟叶片重量体积0.1~0.3倍的0.1M NaCl溶液，同时加入烟叶片重量0.04~0.06倍的711阴离子交换树脂，用组织捣碎机磨浆0.5~1.5min得到匀浆液，将匀浆液过滤得到滤液，调节滤液的pH值为7.3~7.6，快速加热滤液至45~55℃，并维持20~40min，然后迅速冷却至20℃，然后转入离心机离心得到离心上清液；C、FⅠ叶蛋白分离：取B步骤的离心上清液，用(NH4)2SO4盐析，取45%～55%盐析出的蛋白质沉淀段得到沉淀a；D、FⅠ叶蛋白纯化：将沉淀a用柱平衡缓冲液溶解得到蛋白初溶液b，将蛋白初溶液b通过经缓冲液平衡过的葡聚糖凝胶G‑50柱，以1.5ml/min的流速洗脱，收集第6~7ml的洗脱液即为分离得到的FⅠ叶蛋白溶液；E、FⅠ叶蛋白结晶：向收集的FⅠ叶蛋白溶液中加入等体积的0.025M Tris‑Cl，pH7.4缓冲液得到稀释后的蛋白流出液，于4℃静置结晶得到FⅠ叶蛋白结晶。...

【技术特征摘要】
1.一种烟叶中FⅠ叶蛋白提取和分离纯化方法，其特征在于所述的烟叶中FⅠ叶蛋白提取和分离纯化方法包括样品采集、FⅠ叶蛋白提取、FⅠ叶蛋白分离、FⅠ叶蛋白纯化、FⅠ叶蛋白结晶步骤，具体包括：A、样品采集：采集绿色烟叶，然后避光存放6~24h备用；B、FⅠ叶蛋白提取：将A步骤得到的烟叶片去掉主脉，置入组织捣碎机中，加入烟叶片重量体积0.1~0.3倍的0.1MNaCl溶液，同时加入烟叶片重量0.04~0.06倍的711阴离子交换树脂，用组织捣碎机磨浆0.5~1.5min得到匀浆液，将匀浆液过滤得到滤液，调节滤液的pH值为7.3~7.6，快速加热滤液至45~55℃，并维持20~40min，然后迅速冷却至20℃，然后转入离心机离心得到离心上清液；C、FⅠ叶蛋白分离：取B步骤的离心上清液，用(NH4)2SO4盐析，取45%～55%盐析出的蛋白质沉淀段得到沉淀a；D、FⅠ叶蛋白纯化：将沉淀a用柱平衡缓冲液溶解得到蛋白初溶液b，将蛋白初溶液b通过经缓冲液平衡过的葡聚糖凝胶G-...

【专利技术属性】
技术研发人员：李军营，晋艳，马俊红，马二登，逄涛，王立冬，
申请(专利权)人：云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：云南;53