The invention provides a method for detection of GC MS primary metabolites and secondary metabolites in fresh tobacco leaves, the method comprises the steps as follows: rapid acquisition of fresh tobacco leaves and field Frozen with liquid nitrogen and transferred to dry ice in low temperature back to the laboratory, using freeze drying to remove water by freezing and drying machine, and the grinding mill with tobacco, 40 mesh sieve, solvent ultrasonic extraction of crushed tobacco in primary and secondary metabolites, to extract the supernatant dried with nitrogen, and then extract on drying of oximation reaction, silane derivatization reaction, finally using GC MS analysis. The utility model has the advantages that the tobacco leaf collecting method can truly reflect the period of growth and development, the place of collection, the variety and the origin of the tobacco leaves. The tobacco extraction and detection method can cover the primary and secondary metabolites in fresh tobacco leaves, such as sugar, amino acids, organic acids, sterols, alkaloids, polyphenols, has characteristics of high throughput detection, and selected ion monitoring method of primary metabolites and secondary metabolites of accurate qualitative in fresh tobacco leaves 199 (Standard Test 135).
【技术实现步骤摘要】
一种GC-MS检测新鲜烟叶中初生代谢物和次生代谢物的方法
本专利技术涉及烟草代谢组学新鲜烟叶中代谢物检测的研究,具体是一种气相色谱-串联质谱法检测新鲜烟叶中初生代谢物糖、氨基酸、有机酸和次生代谢物甾醇、生物碱、多酚等的检测方法。
技术介绍
烟草作为重要的模式作物,人们对其化学组成主要局限于调制后烟叶的研究,对于新鲜烟叶,包括不同生长发育时期、采集部位、品种和产地的化学组成了解十分有限。尽管近几年国内外已经开展了关于烟叶代谢组学的研究,但是所检测和准确定性定量的代谢物数量有限,而新鲜烟叶中初生和次生代谢物与植物的抗性、信号转导、烟叶香气等密切相关。因此,建立一种GC-MS检测新鲜烟叶中初生代谢物和次生代谢物的方法是十分必要的。针对烟叶代谢物的检测,通用的方法包括靶标分析方法和非靶标分析方法。靶标分析方法一般采用选择离子扫描模式(SIM)或多反应监测模式(SRM/MRM),其灵敏度高,受共流峰干扰少,但该方法主要用于特定种类化合物的研究,不满足代谢组学高通量快速分析的要求。同时,这种靶标分析方法根据化合物的类别进行分析,存在样品预处理复杂,需要建立不同的分析方法,只能对已知的化合物进行定性和定量分析的缺点。而非靶标分析方法一般采用全扫描模式,并能产生非偏向的全扫描信息以检测尽可能多的代谢物。然而该类方法也有一些局限性,比如其检测器容易饱和,线性范围较窄,使得浓度范围横跨几个数量级的代谢物的准确定量受到限制。另外,可匹配到的代谢物数目和峰匹配结果的准确度受到峰匹配参数的影响,由于软件算法的不完善和数据的复杂性会导致一些错误结果的产生,进而影响到数据预处理结果的准 ...
【技术保护点】
一种GC‑MS检测新鲜烟叶中初生代谢物和次生代谢物的方法,其特征在于:采用提取溶剂低温超声萃取并衍生,通过气相色谱‑质谱联用仪GC‑MS实现新鲜烟叶中初生代谢物糖、氨基酸、有机酸和次生代谢物甾醇、生物碱、多酚的检测,具体步骤如下:1)烟叶的采集、干燥和粉碎:采摘烟株指定部位烟叶,迅速用液氮迅速冷冻以保证代谢物不发生降解;其中,冻干机预冷到‑40℃,冷冻干燥72h以除去烟叶中水分,之后用粉碎机粉碎,过40目筛,放于‑80℃冰箱保存;2)称量10‑30mg粉碎后的烟叶置于离心管中,加入100μL的内标溶液,用1mL的异丙醇‑乙腈‑水萃取溶剂超声提取,超声萃取后4000r/min离心10min,取上清液并用氮吹仪吹干;3)向吹干的提取液中加入甲氧胺盐酸盐的吡啶溶液,涡旋振荡后在35‑40℃条件下进行肟化反应90‑120min;该反应可以对糖等代谢物的醛基进行肟化保护,减少其异构体,便于定量比较;4)向上述溶液中加入作为衍生化试剂的N‑甲基‑N‑三甲基硅烷三氟乙酰胺MSTFA,涡旋振荡后在35‑40℃下进行硅烷衍生化反应30‑60min;5)采用GC‑MS进行检测,色谱质谱条件如下:GC部分: ...
【技术特征摘要】
1.一种GC-MS检测新鲜烟叶中初生代谢物和次生代谢物的方法,其特征在于:采用提取溶剂低温超声萃取并衍生,通过气相色谱-质谱联用仪GC-MS实现新鲜烟叶中初生代谢物糖、氨基酸、有机酸和次生代谢物甾醇、生物碱、多酚的检测,具体步骤如下:1)烟叶的采集、干燥和粉碎:采摘烟株指定部位烟叶,迅速用液氮迅速冷冻以保证代谢物不发生降解;其中,冻干机预冷到-40℃,冷冻干燥72h以除去烟叶中水分,之后用粉碎机粉碎,过40目筛,放于-80℃冰箱保存;2)称量10-30mg粉碎后的烟叶置于离心管中,加入100μL的内标溶液,用1mL的异丙醇-乙腈-水萃取溶剂超声提取,超声萃取后4000r/min离心10min,取上清液并用氮吹仪吹干;3)向吹干的提取液中加入甲氧胺盐酸盐的吡啶溶液,涡旋振荡后在35-40℃条件下进行肟化反应90-120min;该反应可以对糖等代谢物的醛基进行肟化保护,减少其异构体,便于定量比较;4)向上述溶液中加入作为衍生化试剂的N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺MSTFA,涡旋振荡后在35-40℃下进行硅烷衍生化反应30-60min;5)采用GC-MS进行检测,色谱质谱条件如下:GC部分:色谱柱:DB-5ms(30m×0.25mm×0.25μm);载气:He;进样量:1μL;分流比:10:1;流速:1.0mL/min;程序升温:70℃(4min)升到300℃(5min),以5℃/min的速率,进样口温度300℃;MS部分:...
【专利技术属性】
技术研发人员:陈霞,周会娜,翟妞,李锋,徐国云,王燃,郑庆霞,陈千思,王晨,申晓晔,
申请(专利权)人:中国烟草总公司郑州烟草研究院,
类型:发明
国别省市:河南,41
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。