蛋白的高水平表达制造技术

一种编码在真核细胞中正常表达的蛋白的合成基因，其中在编码所述蛋白的天然基因中，至少１个非优选或较不优选的密码子已被编码相同氨基酸的优选密码子所置换，在体外哺乳动物细胞培养系统中，在相等条件下，所述的合成基因能表达的该蛋白水平，至少为所述的天然基因表达水平的１１０％。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及在真核细胞中，高水平表达真核生物蛋白和病毒蛋白的基因和方法。
技术介绍
在原核生物中表达真核基因产物，有时因存在在大肠杆菌中不常使用的密码子而受到限制。上述基因的表达，可用高表达原核基因的密码子系统地替换内源密码子的方法而增强(Robinson等，核酸研究126663,1984)。一般认为，稀有密码子引起核糖体暂停，导致不能完成新生的多肽链和转录及翻译的解偶联。核糖体的暂停被认为引起mRNA的3′末端与细胞的核糖核酸酶的接触。专利技术概述本专利技术涉及一种合成的基因，该基因编码在哺乳动物细胞或其它真核生物细胞中正常地表达的蛋白，其中在编码该蛋白的天然基因中，至少一个非优选的或较不优选的密码子已被编码相同氨基酸的优选密码子所置换。优选的密码子是Ala(gcc)；Arg(cgc)；Asn(aac)；Asp(gac)；Cys(tgc)’Gln(cag)；Gly(ggc)；His(cac)；Ile(atc)；Leu(ctg)；Lys(aag)；Pro(ccc)；Phe(ttc)；Ser(agc)；Thr(acc)；Tyr(tac)；和Val(gtg)。较不优选的密码子是Gly(ggg)；Ile(att)；Leu(ctc)；Ser(tcc)；Val(gtc)和Arg(agg)。所有不符合优选密码子和较不优选的密码子说明的密码子为非优选密码子。一般来说，特殊密码子的优选程度由在高表达的人类基因中密码子的使用程度来表示，如在表1中标题“高”下所列出。例如，在高表达的哺乳动物基因中，“atc”代表77％的Ile密码子、是优选的Ile密码子。在高表达的哺乳动物基因中，“att”代表18％的Ile密码子，为较不优选的Ile密码子。在高表达的人类基因中，“ata”序列仅代表5％的Ile密码子，称为非优选的Ile密码子。用在高表达的人类基因中更常出现的另一个密码子置换密码子，一般来说会增加基因在哺乳动物细胞中表达。相应地，本专利技术包括用优选的密码子取代较不优选的密码子，以及用优选或较不优选的密码子置换非优选的密码子。“在哺乳动物细胞中正常表达的蛋白”指的是自然条件下在哺乳动物中表达的蛋白。该术语包括在哺乳动物基因组中的基因，如编码因子Ⅷ、因子Ⅸ、白细胞介素和其它蛋白的基因。该术语也包括在疾病条件下哺乳动物细胞中表达的基因，如癌基因及在感染后哺乳动物细胞表达的由病毒(包括逆转录病毒)所编码的基因。术语“在真核细胞中正常表达的蛋白”，指的是自然条件下在真核生物中表达的蛋白。该术语也包括疾病条件下在哺乳动物细胞中表达的基因。在优选的实施方案中，在体外哺乳动物细胞培养系统中，在相同的条件下(即，同样细胞类型、同样的培养条件、同样的表达载体)，合成的基因能够表达哺乳动物或真核生物蛋白的水平至少为“天然的”(或“天生的”)基因所表达的110％、150％、200％、500％、1,000％、5,000％，或甚至为10,000％。如下描述了用于测定合成的基因和相应的天然基因表达的合适的细胞培养系统。其它合适的采用哺乳动物细胞的表达系统，在本领域的技术人员中是众所周知的，并在下面注明的标准的分子生物学参考书中有描述。下面和如下所述的标准参考书中描述了适于表达合成基因和天然基因的载体。术语“表达”意指蛋白表达。用对目的蛋白特异的抗体测定表达。上述抗体和测定技术在本领域的技术人员中众所周知。术语“天然基因”和“天生基因”，意指天然地编码蛋白的基因序列(包括天然发生的等位变异体)，即天生或天然的编码序列。在其他优选的实施方案中，天然基因中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的密码子是非优选的密码子。在其他优选的实施方案中，天然基因中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的非优选密码子被优选密码子或较不优选的密码子所置换。在其他优选的实施方案中，天然基因中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的非优选密码子可以用优选密码子或较不优选的密码子所置换。在一优选的实施方案中，蛋白是逆转录病毒蛋白。在一更优选的实施方案中，蛋白是慢病毒蛋白。在进一步更优选的实施方案中，蛋白是HIV蛋白。在其他优选的实施方案中，蛋白是gag、pol、env、gp120或gp160。在其他优选的实施方案中，蛋白是人蛋白。在更优选的实施方案中，蛋白是人因子Ⅷ和B区缺失的人因子Ⅷ的蛋白。在另一优选的实施方案中，蛋白是绿色荧光蛋白。在各种优选的实施方案中，合成基因中至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和95％的密码子是优选的或较不优选的密码子。本专利技术也涉及包含合成基因的表达载体。在另一方面，本专利技术涉及包含合成基因的细胞。在各种优选的实施方案中，细胞是原核细胞，以及细胞是哺乳动物细胞。在优选的实施方案中，合成基因包括比50更少、比40更少、比30更少、比20更少、比10更少、比5更少或没有“cg”的序列。本专利技术也涉及提供一种制备合成基因的方法，该合成基因编码，由哺乳动物细胞或其它真核细胞正常表达的蛋白。该方法包括，在编码蛋白的天然基因中鉴别非优选的和较不优选的密码子，并且用编码相同氨基酸的优选密码子作为置换密码子，置换一个或多个非优选和较不优选的密码子。在某些情况下(例如，允许引入限制性位点)，可能需要用较不优选的密码子而不是优选密码子置换非优选密码子。没有必要用优选的密码子置换所有较不优选的或非优选的密码子。甚至用优选的密码子部分置换较不优选或非优选的密码子就可实现表达的增加。在某些情况下，为了获得中等水平的表达，用优选的或较不优选的密码子仅仅部分置换非优选密码子，就可合乎要求。在其他优选的实施方案中，本专利技术涉及包含一种或多种合成基因的载体(包括表达载体)。术语“载体”意指一种如来源于质粒、噬菌体、或哺乳动物或昆虫病毒的DNA分子，DNA片段可插入或克隆进载体之中。载体可含有一个或多个唯一的限制性位点，能在确定的宿主或载体生物自主复制，这样克隆序列是可以重复产生的。因此，术语“表达载体”意指任何能指导蛋白合成的自主元件。上述DNA表达载体包括哺乳动物质粒和病毒。本专利技术也涉及编码蛋白所需部分的合成基因片段。除了它们仅编码蛋白的一部分外，上述合成基因片段与本专利技术的合成基因相似。优选的上述合成基因片段，至少编码蛋白50、100、150或500个邻近的氨基酸。在构建本专利技术的合成基因中，避免CpG序列合乎要求。因为这些序列可引起基因沉默。因此，在一优选的实施方案中，合成基因的编码区不包括“cg”序列。在HIV gp120env基因中存在的密码子偏倚，也在gag和pol基因中存在。因而，在这些基因中找到的非优选和较不优选的一部分密码子，用优选的密码子置换应该产生能较高水平表达的基因。在编码因子Ⅷ和因子Ⅸ的人基因中，大部分密码子是非优选的密码子或较不优选的密码子。用优选的密码子置换一部分这些密码子，应该产生能在哺乳动物细胞培养中更高水平表达的基因。本专利技术的合成基因能导入到活生物的细胞中。例如，载体(病毒或非病毒)能用于把合成基因导入到活生物的细胞中，以进行基因治疗。反之，作为一种降低表达的方法用较不优选的密码子置换天然产生的基因中的优选密码子是合乎需要本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：B·瑟德，J·哈斯，
申请(专利权)人：综合医院公司，
类型：发明
国别省市：