细胞片叠层化物的制造方法、由该方法得到的具有血管网的细胞片叠层化物及其利用方法技术

一种细胞片叠层化物的制造方法，其特征在于，制作具有动静脉袢、且构建了毛细血管网的血管床，向该血管床上叠层细胞片，通过在活体外灌注培养基而在细胞片内构建血管网。根据该制造方法，可以在细胞片内构建血管网，如果将该细胞片进行叠层化，则可简便地制作具有厚度的细胞片叠层化物。这样的具有厚度的细胞片叠层化物作为活体内组织样的物质，在各种组织的再生医疗、和/或药剂等的评价中是有用的。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及在医学、生物、药物开发、药学等领域有用的。本申请是主张2010年9月14日提出的日本申请(日本特愿2010-225200)为基础的优先权的申请。
技术介绍
今天，动物细胞培养技术显著进步，以动物细胞为对象的研究开发也广泛在各种领域被实施。成为对象的动物细胞的使用方法也不仅是开发当初的将细胞本身制品化、将其产生物制品化，现在通过分析细胞和/或其细胞表层蛋白质来设计有效的药物、将患者本人的细胞在活体外再生、或者提高其功能然后送回活体内进行治疗等方式也在逐渐被实施。现在，动物细胞的培养技术、以及评价、分析、利用的技术是研究者关注的一个领域。但是，包含人细胞在内，动物细胞大多是附着依赖性的。即，要在活体外培养动物细胞时，需要使它们一次性附着于基材表面。并且，不能将培养的细胞剥离成一个一个，还需要保持在该基材表面上培养的形态使其剥离。特别对于使患者本人的细胞在活体外再生的技术而言，近年来，将治疗困难的脏器替换成他人的脏器的脏器移植已经一般化。成为对象的脏器也实际上多样化为皮肤、角膜、肾脏、肝脏、心脏等，另外，术后恢复也特别良好，作为一种医疗技术已经逐渐被确立。作为一例列举角膜移植，约50年前日本也设立眼库开始了移植活动。然而，据说供体数尚且少，仅国内每年需要角膜移植的患者约由2万人，与此相对，实际进行移植治疗的患者仅为约1/10的2000人左右。虽然有角膜移植这样基本确立的技术，但由于供体不足这样的问题，现状是要求其他的医疗技术。基于这样的背景，开发了要将患者本人的正常细胞培养至所需大小将其移植的技术。日本特开平02-21 1865号公报(专利文献I)显示了在用对水的上限或者下限临界溶解温度为0 80°C的聚合物包覆了基材表面而得的细胞培养支撑体上，将细胞在上限临界溶解温度以下或下限临界溶解温度以上培养，然后调整到上限临界溶解温度以上或下限临界溶解温度以下，从而无酶处理而剥离培养细胞的新的细胞培养法。另外，日本特开平05-192138号公报(专利文献2)记载了，通过利用该温度应答性细胞培养基材将皮肤细胞在上限临界溶解温度以下或者下限临界溶解温度以上培养，然后调整至上限临界溶解温度以上或者下限临界溶解温度以下，从而以低损伤剥离培养皮肤细胞。通过利用温度应答性细胞培养基材，可以对现有的培养技术谋求各种新的展开。进而，日本再表02-008387号公报(专利文献3)中发现，在用温度应答性聚合物包覆了基材表面的细胞培养支撑体上培养心肌组织的细胞，得到心肌样细胞片，然后，使培养液温度为上限临界溶解温度以上或下限临界溶解温度以下，使培养的多层化细胞片粘附于聚合物膜，直接与聚合物膜一起剥离，并且用规定的方法使其3维结构化，从而可以构建结构缺陷少、作为活体外(in vitro)的心肌样组织具有数种功能的细胞片、和3维结构。然而，在上述的现有技术中，心肌样细胞片的叠层化不能无限进行，3层左右为极限，强烈要求能够简便地多次叠层化的技术。为了解决如上问题，FASEB.J.，20 (6)，708-710 (2006)(非专利文献I)中尝试了在活体内将细胞片叠层化，显示得到了厚的心肌片叠层化物。其中，已知为了获得有厚度的细胞片叠层化物，必须向被叠层化的各细胞或者各细胞片供给营养和/或氧，但在FASEB.J.，20 (6)，708-710 (2006)(非专利文献I)的方法中，需要反复向活体内移植细胞片，其必须相应于其次数地将移植部位开口，是对于被移植侧强加了大的负担的方法，强烈要求解决该课题的、能够简便地多次叠层化的技术。现有技术文献专利文献专利文献1:日本特开平02-211865号公报专利文献2:日本特开平05-192138号公报专利文献3:日本再表02-008387号公报非专利文献非专利文献1:FASEB.J.,20(6) ,708-710(2006)
技术实现思路
专利技术要解决的课题 本专利技术的目的是解决如上所述的关于细胞片的叠层化的问题。即，本专利技术提供基于与现有技术完全不同想法创造的新的。用于解决课题的方法本专利技术者们为了解决上述课题而从各种角度实施研究而进行了研究开发。其结果发现，可以制作具有动静脉袢、且构建了毛细血管网的血管床，向该血管床上叠层细胞片，通过在活体外灌注培养基而在细胞片内构建血管网，从而能简便地将细胞片较厚地进行叠层化。另外，利用由该方法得到的带血管网的细胞片叠层化物，可在活体外评价药剂对活体组织的效果。本专利技术是基于该见解而完成的。S卩，本专利技术提供一种细胞片叠层化物的制造方法，其特征在于，制作具有动静脉袢、构建了毛细血管网的血管床，向该血管床上叠层细胞片，相对于活体内的组织片，通过在活体外灌注培养基而在细胞片内构建血管网。进而，本专利技术提供利用该细胞片叠层化物的方法。认为本专利技术是使用由利用血管床而能够在活体外制作有厚度的细胞片叠层化物这样的在世界上没有类似的新的想法而获得的细胞结构物而首次实现的极为重要的专利技术。另夕卜，在本专利技术中，有时将细胞片叠层化物表达为细胞片叠层体、多层化细胞片叠层体，但都表示将细胞片进行多片叠层而得的物质，并不因这些表达的不同而受到任何限制。专利技术的效果根据本专利技术所示的制造方法，只要在细胞片内构建血管网，将该细胞片叠层化，就可以简便地制作有厚度的细胞片叠层化物。这样的有厚度的细胞片叠层化物可以作为活体内组织样的物质进行移植，可期待成为在各种组织的再生医疗中有用的物质。另外，利用通过利用血管床得到的带有血管网的细胞片叠层化物，从而可以简便地在活体外评价药剂对活体组织的效果。这样的评价体系不仅可代替实验动物，还可得到不依赖动物的个体差异的稳定的数据。附图说明图1是显示实施例1的血管床制作时的概要的图。图2是显示向实施例1中得到的血管床灌注培养基时的情况的图。图3是显示向实施例1中使用的血管床循环的培养基的概要的图。图4是显示实施例1的细胞片叠层化物内的血管网的情况的图。图5是显示实施例1的细胞片叠层化物内的血管网的情况的图。图6是显示实施例2的细胞片叠层化物的活性的图。图7是显示将实施例3的细胞片叠层化物进一步叠层时的情况的图。图8是显示探索促进实施例4的细胞片叠层化物的血管新生的细胞因子的结果的图。由大鼠采取血液，用ELISA法测定血清中所含有的细胞因子浓度。图9是显示实施例5的血管床制作时的概念图的图。图10是显示在实施例4中制作的血管床内新形成的毛细血管的图。箭头所夹的区域为新生的毛细血管。图11是为了确认实施例4中制作的细胞片叠层化物的功能而向活体内进行再移植的图。具体实施例方式本专利技术的目的是简便地制作具有厚度的细胞片叠层化物。因此，要求如上述那样在细胞片叠层化物中构建血管网。为了简便地构建该血管网，本专利技术的特征在于，采取具有动脉及静脉且具有血流的活体组织片，通过在活体外灌注培养基而制成血管床，通过向该血管床叠层细胞片而在细胞片内构建血管网。血管床是在活体组织、脏器中可见的结构，是指合并了毛细血管与其周围的组织的结构。血管床介由无数地遍布于在血管床内的毛细血管的薄壁，实现交换活体组织内的氧、葡萄糖、其他营养素的功能。像二氧化碳这样的老废物向血管床的毛细血管内渗出。在活体组织中组织液相对保持一定是因为存在通过毛细血管的物质交换。本专利技术中，为了在细胞片内有效地构建毛细血管网，并供本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.09.14 JP 225200/20101.细胞片叠层化物，其特征在于，在具有动静脉袢、且构建有毛细血管网的血管床上叠层细胞片，构建通过在活体外灌注培养基而得到的毛细血管网。2.根据权利要求1所述的细胞片叠层化物，其中，血管床为活体组织片。3.根据权利要求2所述的细胞片叠层化物，其中，活体组织片为皮瓣。4.根据权利要求2或3所述的细胞片叠层化物，其中，活体组织片来源于肌肉。5.根据权利要求1所述的细胞片叠层化物，其中，血管床在被活体适合性基材分隔的区域内内包动静脉袢，在分隔的区域内填充凝胶，通过留置于活体内来构建毛细血管网。6.根据权利要求5所述的细胞片叠层化物，其中，凝胶包含生物降解性聚合物和/或细胞。7.根据权利要求1 6的任一项所述的细胞片叠层化物，其中，培养基包含与血管新生促进有关的细胞因子。8.根据权利要求1 7的任一项所述的细胞片叠层化物，其中，细胞片是如下获得的:在表面包覆了在O 80°C的温度范围内水合力变化的聚合物的细胞培养支持体上，在聚合物的水合力弱的温度区域培养细胞，然后，使培养液变化至形成聚合物的水合力强的状态的温度进行培养，将培养而得的细胞以片状剥离。9.根据权利要求1 8的任一项...

【专利技术属性】
技术研发人员：关根秀一，清水达也，冈野光夫，
申请(专利权)人：学校法人东京女子医科大学，
类型：
国别省市：