多能干细胞的分化制造技术

本发明专利技术提供了促进多能干细胞分化成胰岛素产生细胞的方法。具体地讲，本发明专利技术提供了利用降解视黄酸的试剂产生胰腺内分泌前体细胞群的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术提供了促进多能干细胞分化成胰岛素产生细胞的方法。具体地讲，本专利技术提供了利用降解视黄酸的试剂产生胰腺内分泌前体细胞的方法。
技术介绍
用于I型糖尿病的细胞替代疗法的进展以及可移植胰岛的缺乏已使得注意力集中在开发适于移植物移入的胰岛素产生细胞或β细胞的来源上。一种方法是从多能干细胞，例如胚胎干细胞产生功能性β细胞。在脊椎动物的胚胎发育中，多能干细胞可在称为原肠胚形成的过程中产生包括三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的细胞群。诸如甲状腺、胸腺、胰腺、肠和肝脏之类的组织将从内胚层，经由中间阶段发育而来。该过程中的中间阶段是形成定形内胚层。定形内胚层细胞可表达多种标志物，如HNF3P、GATA4、MIXLl、CXCR4和S0X17。定形内胚层分化成胰腺内胚层导致形成胰腺。胰腺内胚层细胞表达胰-十二指肠同源盒基因roxi。在不存在roxi时，胰腺形成腹胰芽和背胰芽后不再发育。因而，pdxi表达标志着胰腺器官发生中的一个关键步骤。除了其它细胞类型，成熟的胰腺还包括外分泌组织和内分泌组织。外分泌和内分泌组织来自胰腺内胚层的分化。在体内的胰腺发育至少部分依赖于指定器官祖先领域的信号的适当调节。Kinkel等人(PNAS《美国科学院院刊》2009年5月12日，第106卷，第19期，7864-7869)声称“胰腺细胞命运由视黄酸(RA)指定，并且胰腺领域的合适大小和定位取决于RA信号的紧密控制。此处，我们显示RA降解Cyp26酶在限定胰腺领域的正常前限中起关键作用。”据报道，从小鼠的胚胎细胞衍生了带有胰岛细胞特征的细胞。例如，Lumelsky等人(Science《科学》292 =1389,2001)报道了小鼠胚胎干细胞向类似于胰岛的胰岛素分泌结构的分化。Soria等人(Diabetes《糖尿病》49 =157,2000)报道了衍生自小鼠胚胎干细胞的胰岛素分泌细胞使链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠中的血糖变正常。在一个例子中，Hori等人(PNAS《美国科学院院刊》99 =16105,2002)公开了用磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂(LY294002)处理小鼠胚胎干细胞产生了类似β细胞的细胞。在另一个例子中，Blyszczuk等人(PNAS《美国科学院院刊》100 =998,2003)报道了从组成型表达Pax4的小鼠胚胎干细胞生成产生胰岛素的细胞。Micallef等人报道了视黄酸可调节胚胎干细胞定向形成roxi阳性胰腺内胚层。在对应于胚胎的原肠胚形成末期的期间，加入胚胎干细胞分化第4天的培养物中时视黄酸在诱导Pdxl方面最有效(Diabetes《糖尿病》54 =301,2005)。Miyazaki等人报道了过表达Pdxl的小鼠胚胎干细胞系。他们的结果显示，夕卜源Pdxl表达在所得的分化细胞中明显增强了胰岛素、生长抑素、葡萄糖激酶、神经元素3、p48、Pax6 和 Hnf6 基因的表达(Diabetes《糖尿病》53:1030，2004)。Skoudy等人报道说，激活素A(TGF-β超家族的成员)能上调小鼠胚胎干细胞中的胰腺外分泌基因(P48和淀粉酶)和内分泌基因(Pdxl、胰岛素和胰高血糖素)的表达。使用InM激活素A观察到最大效应。他们还观察到胰岛素和PdxlmRNA的表达水平不受视黄酸的影响；然而，3nM FGF7处理导致了 Pdxl的转录水平升高(Biochem.J.《生物化学杂志》379 =749,2004)。Shiraki等人研究了能特征性增强胚胎干细胞分化成TOXl阳性细胞的生长因子的效果。他们观察到，TGF-β 2可再现地产生更高比例的roxi阳性细胞(Genes Cells.2005年 6 月；10(6) =503-16)。Gordon等人阐明了在没有血清存在有激活素连同Wnt信号传导抑制剂存在的情况下从小鼠胚胎干细胞诱导短尾蛋白(brachyury)[阳性]/HNF30 [阳性]内胚层细胞(US2006/0003446A1)。Gordon等人(PNAS《美国科学院院刊》，第103卷，第16806页，2006)声称“Wnt和TGF-β /nodal/激活素信号传导同时为生成前原条所必需的”。然而，胚胎干细胞发育的小鼠模型可能不会完全模拟高等哺乳动物(例如人)中的发育程序。Thomson等人从人胚泡分离了胚胎干细胞(Science《科学》282:114,1998)。同时，Gearhart和其同事从胎儿生殖腺组织衍生了人胚胎生殖(hEG)细胞系(Shamblott等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA《美国科学院院刊》95:13726，1998)。与可简单通过与白血病抑制因子(LIF) —起培养来防止分化的小鼠胚胎干细胞不一样，人胚胎干细胞必须维持在非常特殊的条件下(美国专利N0.6，200，806 ；W099/20741 ；W001/51616)。D’ Amour等人 描述了在高浓度激活蛋白和低血清的存在下产生人胚胎干细胞衍生的定形内胚层的富集培养物(Nature Biotechnology《自然生物技术》2005)。将这些细胞移植到小鼠的肾囊下，导致分化成具有某些内胚层器官的特性的更成熟细胞。在加入FGF-1o之后，人胚胎干细胞衍生的定形内胚层细胞可进一步分化成roxi阳性细胞(US2005/0266554A1)。D’ Amour 等人.(Nature Biotechnology《自然生物技术》-24,1392-1401 (2006))声称:“我们已开发出使人胚胎干(hES)细胞转化成能够合成胰腺激素胰岛素、胰高血糖素、生长抑素、胰多肽和生长激素释放肽的内分泌细胞的分化方法。该方法通过引导细胞经过类似于定形内胚层、肠管内胚层、胰腺内胚层和内分泌前体的阶段转变为表达内分泌激素的细胞来模拟体内胰腺器官发生”。在另一个例子中，Fisk等人报道了用于从人胚胎干细胞产生胰岛细胞的系统(US2006/0040387A1)。在该情形中，分化途径分成三个阶段。使用丁酸钠和激活素A混合物将人类胚胎干细胞首先分化成内胚层细胞。随后将该细胞用TGF-β拮抗剂例如头蛋白与EGF或乙胞素的混合物培养以生成roxi阳性细胞。通过烟酰胺诱导终末分化。因此，仍明显需要开发生成表达胰岛素的功能细胞的体外方法，所述细胞更密切地类似β细胞。本专利技术采取替代方法，通过利用降解视黄酸的试剂生成胰腺前体细胞群改善使多能干细胞向胰岛素表达细胞分化的效率。
技术实现思路
在一个实施例中，本专利技术提供了利用降解视黄酸的试剂产生胰腺内分泌前体细胞的方法。在一个实施例中，利用逐步分化方案达到胰腺内分泌前体细胞群的形成，其中首先使所述多能干细胞群分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞群。接下来，随后使所述表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞群分化成原肠管细胞群。接下来，随后使所述原肠管细胞群分化成后前肠细胞群。接下来，随后通过用补充有降解视黄酸的试剂的培养基处理所述后前肠细胞群，使所述后前肠细胞群分化成内分泌前体细胞群。在一个实施例中，所述内分泌前体细胞群进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞群。附图说明图1 显示了对于 a)PAX4、b)NGN3、c)PDXl、d)NEUR0D、e)NKX6.l、f)CDX2 和 g)白蛋白，得自实例本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.08.31 US 61/378,4801.一种由多能干细胞衍生胰腺内分泌前体细胞群的方法，包括以下步骤: a.培养多能干细胞群； b.使所述多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞群； c.使所述表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成原肠管细胞群； d.使所述原肠管细胞群分化成后前肠细胞群；以及 e.用补充有降解视黄酸的试剂的培养基处理所述后前肠...

【专利技术属性】
技术研发人员：A雷扎尼亚，
申请(专利权)人：詹森生物科技公司，
类型：
国别省市：