本发明专利技术提供用于将成纤维细胞转化为PV神经元的组合物，所述组合物含有Ascl1基因以及FSK中的一种或多种。本发明专利技术还提供了一种将成纤维细胞转化为神经元细胞的方法。本发明专利技术还提供了根据本发明专利技术的方法制备的神经元细胞。在制备用于治疗神经系统疾病的药物中的应用。本发明专利技术还提供了根据本发明专利技术的方法制备的神经元细胞在制备用于治疗神经系统疾病的药物中的应用。本发明专利技术通过试验证明，所述转分化技术可以高效获得PV神经元，移植后很好的治疗癫痫疾病，通过癫痫发作次数的降低，提高记忆力，从而为治疗癫痫及相关疾病的治疗开辟了新的途径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术和神经发育领域。本专利技术具体涉及。
技术介绍
基于干细胞移植技术的再生医学为人类战胜难治性退行性疾病带来了巨大的希望。诱导多能干细胞由于突破了胚胎干细胞的伦理障碍，曾被认为是再生医学的新希望。然而，其诱导效率的低下，批次间的不稳定性及高致瘤性使其很难直接用于疾病治疗。自2010年以来，国内外一些科学家通过表达特定转录因子实现了将一种类型的成体细胞转变为另一种类型的成体细胞或成体干细胞。这一方法被称为“转分化”。这一技术不需要经历多能性干细胞这一中间状态，因此可以降低致癌风险。如果能将人体内的其他细胞直接转变为疾病治疗所需要细胞类型，则可以避免细胞移植带来的一系列问题。因此转分化技术有可能为退行性疾病和器官机械损伤等疾病提供良好的治疗方法，具有广阔的临床应用价值。小白蛋白Parvalbumin(PV)是一种脑中特异的重要的神经元。小白蛋白最先是从蛙与鱼的肌肉中分离出来的一种水溶性酸性蛋白质，分子量大约12K，被称为“低分子白蛋白”。1981年，发现PV存在于神经组织内，并且发现含PV的神经元分布与GABA神经元的分布有很高的一致性，因而开始了神经组织中含PV神经元的研究，也对GABA神经元的研究提出了新的内容。PV神经元在大脑中的分布比较广泛，PV神经元属于GABA神经元家族，在脑中发挥独特的功能，维持脑电活动的平衡，已有报道癫痫疾病可能由于PV神经元的异常引起的。癫痫是神经系统常见疾病之一，癫痫已成为神经内科的第二大常见疾病，患病率仅次于脑卒中。世界卫生组织统计，截止到2013年，我国约有近1000万癫痫患者，其中600万名为活动性癫痫患者，且每年新增癫痫患者40万名，给社会、家庭和个人带来了沉重的负担。癫痫是慢性反复发作性短暂脑功能失调综合征。以脑神经元异常放电引起反复痫性发作为特征。癫痫的发病率与年龄有关。一般认为1岁以内患病率最高，其次为1?10岁以后逐渐降低。癫痫由大脑神经元异常放电，导致短暂中枢神经系统功能失常的慢性脑部疾病，根本原因是兴奋性与抑制性神经递质的失衡。通过移植抑制性神经元治疗此类疾病已经取得了很好的效果。但抑制性神经元的来源极大的限速了癫痫病的治疗。
技术实现思路
因此，本专利技术的目的是针对当前无法高效获得抑制性神经元的不足，提供一种诱导成纤维细胞转分化为神经元细胞的方法。同时，本申请提供了将所述神经元细胞用于治疗神经系统癫痫相关疾病的用途，从而为癫痫或其它神经相关疾病的治疗开辟新的治疗途径。除非特别指明，本说明书中的“PV”神经元均指小白蛋白神经元。除非特别说明，本说明书中的“FSK”均指福思科林(Forskolin)，是一种分离自印度植物(Coleus forskohlii)的天然二猫产物，细胞生理学实验研究中Forskolin通常用来提高环腺苷酸(cAMP)水平。针对上述目的，本专利技术提供的技术方案如下:一方面，本专利技术提供一种组合物，所述组合物用于将成纤维细胞转分化为神经元细胞，所述组合物含有Ascll基因和FSK。优选地，所述神经元细胞为PV神经元细胞。另一方面，本专利技术还提供了上述组合物的用途，所述组合物用于制备将成纤维细胞转分化为神经元细胞，优选PV神经元细胞的试剂。本专利技术还提供了一种用于将成纤维细胞转分化为神经元细胞的培养基，所述培养基中含有FSK，优选地，所述FSK的浓度为5-30 μ Μ，优选10 μ Μ ;优选地，将FSK溶于水，制备为一定浓度的储液，然后用于制备上述培养基，优选地，所述FSK储液的浓度为0.5M-1M ；优选地，所述神经元培养基由DMEM培养基、B-27添加剂、脑源性神经营养因子(BDNF)和FSK组成，其中，所述各成分的比例为每1升培养基中含有980毫升的DMEM培养基，20毫升50XB-27添加剂，10微升10 μ g/ml BDNF以及5_30微升1M的FSK储液。再一方面，本专利技术提供了一种将成纤维细胞转分化为神经元细胞的方法，所述方法包括以下步骤:1)将Ascll基因导入成纤维细胞；优选地，所述成纤维细胞为小鼠成纤维细胞； 优选地，所述成纤维细胞使用DMEM培养基加10%胎牛血清培养基培养；优选地，所述Ascll基因使用腺病毒pAD载体导入成纤维细胞；2)将已导入Ascll基因的成纤维细胞，使用含有FSK的神经元培养基培养；得到神经元细胞。优选地，所述方法还包括步骤3)鉴定神经元细胞，优选地，所述鉴定神经元的方法为免疫组化法。优选地，所述步骤1)是通过包括以下步骤的方法实现的:a.腺病毒载体构建:将Ascll基因通过BamHI+EcoRI双酶切构建到腺病毒pAD载体；b.小鼠成纤维细胞细胞的制备:选取14.5天的小鼠胚胎，取皮肤组织，用0.5%胰酶消化，使用DMEM加10%胎牛血清培养消化后的皮肤成纤维细胞，2天后传代一次，得到成纤维细胞；c.病毒感染:使用步骤a构建的Ascll腺病毒颗粒，感染成纤维细胞，从而将Ascll基因导入成纤维细胞；优选地，所述步骤1)是通过包括以下步骤的方法实现的:将Ascll基因导入成纤维细胞6小时后。使用本专利技术所述的培养基培养，之后每两天更换一次培养基，诱导10后，得到神经元细胞。优选地，所述鉴定神经元细胞是通过包括以下步骤的方法实现的:将神经元细胞通过4%多聚甲醛固定，之后用5% BSA封闭，之后用兔的Tujl —抗孵育过夜，第二天用PBS洗3遍，然后用cy3链接的驴抗兔的二抗孵育1小时，在荧光显微镜下观测细胞形态和染色结果。再一方面，本专利技术还提供了根据本专利技术的方法制备的神经元细胞。本专利技术提供了上述组合物在制备用于治疗神经系统疾病的药物中的应用。本专利技术还提供了根据本专利技术的方法制备的神经元细胞在制备用于治疗神经系统疾病的药物中的应用。优选地，所述神经系统疾病为癫痫病。本专利技术通过试验证明，所述转分化技术可以高效获得PV神经元，移植后很好的治疗癫痫疾病，通过癫痫发作次数的降低，提高记忆力，从而为治疗癫痫及相关疾病的治疗开辟了新的途径。【附图说明】以下，结合附图来详细说明本专利技术的实施方案，其中:图1为本专利技术获得的神经细胞；其中，A图为感染的GFP细胞；B图为神经元特异抗体Tu j 1免疫组化染色；C图为感染GFP细胞与Tujl染色共标；“GFP”代表感染的成纤维细胞，“Tujl”代表转分化神经元的Tujl抗体染色，“GFP/Tujl”绿色的感染细胞有多少转分化为神经元；图2表明转分化神经细胞是PV神经元；其中，A图为PV神经元特异抗体PV免疫组化染色；B图为神经元特异抗体Tujl免疫组合染色；C图为PV与Tu j 1抗体染色共标；其中:“PV”代表PV神经元特异标记PV抗体染色，“Tujl”代表转分化神经元的Tujl抗体染色；图3为移植神经细胞的示意图，其中1处为移植细胞，2处为海马区DAPI染色；图4表明的是制作癫痫小鼠的模型，其中左边是正常小鼠对照组，右边是癫痫小鼠模型组；图5表明癫痫小鼠移植抑制性PV神经元后，旷场实验表明小鼠癫痫症状得到恢复其中:“0)11壮01”代表正常对照组，1?11印#”代表癫痫小鼠组，“？￥-!1(:”代表移植组；【具体实施方式】除非特别指明，以下实施例中所用的C57BL/6J小鼠均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。除非特别指明，以下实施本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种组合物，所述组合物用于将成纤维细胞转分化为神经元细胞，所述组合物包括Ascl1基因和FSK；优选地，所述神经元细胞为PV神经元细胞。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：焦建伟，史子啸，
申请(专利权)人：中国科学院动物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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