一种小桐子蔗糖转运蛋白同源基因的克隆方法技术

本发明专利技术属于分子生物学及基因工程技术领域，公开了一种小桐子蔗糖转运蛋白同源基因(JcSUT1,JcSUT3,JcSUT4)的克隆方法。克隆方法包括以下操作步骤：应用如SEQ ID NO：1所示的引物F，如SEQ ID NO：2所示的引物R，进行反转录PCR扩增JcSUT1；应用如SEQ ID NO：3所示的引物F，如SEQ ID NO：4所示的引物R，进行反转录PCR扩增JcSUT3；应用如SEQ ID NO：5所示的引物F，如SEQ ID NO：6所示的引物R，进行反转录PCR扩增JcSUT4。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学及基因工程
，具体设及一种小桐子薦糖转运蛋白 同源基因（JcSUTl，JcSUT3，JcSUT4)的克隆方法。
技术介绍
小桐子（Jatro地a州；Teas)又名麻疯树，为大戟科麻疯树属植物，是一种重要的生 物能源树种。众所周知，绿色植物是通过光合作用合成有机物并W碳水化合物的形式运输 到各个组织和器官从而完成其生长发育的整个生命过程。薦糖作为其运输的主要形式在薦 糖转运蛋白的作用下从源组织转运到初皮部中，然后沿着初皮部长距离运输，最终卸载到 植物的库细胞中。总而言之，薦糖对植物生长和发育起着至关重要的作用。小桐子虽然属 于高光效植物，但是其种实产量很低，特别是种子油含量参差不齐，运极大地限制了生物柴 油产业化的应用。因此，克隆编码小桐子薦糖转运蛋白的基因，对进一步阐明小桐子薦糖运 输过程和作用机制的W及产量性状的遗传改良具有重要的理论意义。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供一种小桐子薦糖转 运蛋白同源基因（JcSUTl，JcSUT3，JcSUT4)的克隆方法。 本专利技术的目的通过下述技术方案实现： -种小桐子薦糖转运蛋白同源基因的克隆方法，包括W下操作步骤：应用如SEQ IDN0:1所示的引物F，如SEQIDN0:2所示的引物R，进行反转录PCR扩增JcSUTl;应用如 SEQIDN0:3所示的引物F，如SEQIDN0:4所示的引物R，进行反转录PCR扩增JcSUT3; 应用如SEQIDNO:5所示的引物F，如SEQIDNO:6所示的引物R，进行反转录PCR扩增 JcSUT4。 所述PCR的反应条件是：94°C预变性2min，98°C变性10sec，55°C退火30sec，68°C 延伸2min，将变性、退火和延伸Ξ个步骤重复35个循环；循环结束后，68°C再延伸7min，4°C 冷却lOmin;反应后加 3μ1dNTPs、0. 5μ1Taq酶，72°C反应 20min。 所述PCR的体系是： Buffbr 25μ1 浓巧为2.5nmol·L-1 的dNTP?ΟμΙ c.DNA第一链模板 1μ1 Primer-FI5μ! Primer-R 1.5μ1 KODFX 1μ! ddll]0 9μΙ。 所述cDNA第一链模板是按照W下方法合成： (1)在RNase-free的PCR管中配置下列溶液： 5XIScriptreactionmix 4μ1含 1μgRNA的溶液 Xμ1IScriptreversetranscriptase 1μ1 Nuclease-free water补齐至 20μ1 ;所述X《15 ; (2)将步骤（1)所得溶液吹打均匀，置于PCR中，WW下条件进行反转录扩增： 25°C反转录引物和模板RNA退火结合5min，42°C延伸30min，85°C保持5min把合成的cDNA 和RNA变性打开得到cDNA，然后4°C恒溫保存。 所述RNA是按照W下提取方法得到： (1)收集lOOmg冰冻的小桐子样品在离屯、管中，在组织解冻之前，加入500μ1的 BufferR化和β-琉基乙醇的混合液，满旋震荡30s，使样品充分混匀；所述BufferR化和 β-琉基乙醇的体积比为1 :50 ; (2) 55°C金属浴1~3min;接着室溫下W速度14000巧m离屯、5min;[001引 做将上清液转移到含有曲NA过滤柱的2ml收集管中，并在室溫下W速度 14000巧m离屯、2min; (4)加入相等体积的BufferRCB到下清液中，并通过移液器吸打混合液5~10 次，使之充分混匀； (5)将步骤（4)中所得的混合液吸取一半加入到含有一个化BincfRNAMin的过滤 柱的2ml收集管中，并在室溫下W速度1000化pm离屯、Imin;离屯、后弃滤液，并将过滤柱放 回到收集管中；[002引 （6)将步骤（4)中剩余混合液加入到过滤柱中，并在室溫下W速度1000化pm离屯、 Imin;离屯、后弃滤液，并将过滤柱放回到收集管中； (7)加入300μ1RWCWashBuffer至过滤柱，在室溫下W速度10000巧m离屯、 Imin； 做弃滤液，加入75μ1Dnasedigestion反应液至过滤柱中央滤膜上；所述 Dnasedigestion是将OBIDnaselDigestionBuffer73. 5μ1 和RNase-freeDnaseI 1. 5μ1颠倒混匀而成的混合液；[00幼 （9)室溫下，静置15min;[002引 （10)将过滤柱放置于干净的2ml收集管中，加入400μ1RWCWashBuffer于室溫 下静置5min;然后在室溫下W速度1000化pm离屯、Imin; (11)弃滤液，将过滤柱放回到收集管内，并加入500μ1RNAWashBufferII;然 后在室溫下W速度10000巧m离屯、Imin;所述RNAWashBufferII在使用前用48ml的无水 乙醇稀释；[002引重复步骤（11)操作一次，然后空转2min; (13)将过滤柱转移至纯净的1. 5ml离屯、管内，加入40μ1DEPC水溶解RNA; (14)室溫下，静置 5min; (15)室溫下，10000巧m离屯、Imin，即可得到RNA，用核酸快速测定仪和琼脂糖凝胶 电泳测浓度与纯度。 -种由权利要求1所述的克隆方法获得的小桐子薦糖转运蛋白同源基因JcSUTl， 所述的小桐子薦糖转运蛋白同源基因JcSUTl的核巧酸基因序列如SEQIDN0:7所示。具 体女曰下；Seqlsucerosetransporter IcDNA,completeCDS -种由权利要求1所述的克隆方法获得的小桐子薦糖转运蛋白同源基因JcSUT3， 其特征在于：，所述的小桐子薦糖转运蛋白同源基因JcSUT3的核巧酸基因序列如SEQID NO:8 所示。具体如下：Seq2suce;rose transporter3cDNA,completeCDS 一种小桐子薦糖转运蛋白同源基因JcSUT4,其特征在于：由权利要求1所述的 克隆方法获得，所述的小桐子薦糖转运蛋白同源基因JCSUT4的核巧酸基因序列如SEQID NO:9 所不D具体如下：Seq3sucerose transporter4cDNA，completeCDS与现有技术相比，本专利技术具有W下优点及有益效果：本专利技术设计的特异引物和特 定的PCR扩增步骤能够有效的克隆出小桐子JcSUTl、JCSUT3、JCSUT4的CDS序列。【附图说明】 图1是小桐子JcSUTl的cDNAPCR产物电泳图谱，其中1、2均为JcSUTl的cDNA PCR产物条带。 图2是小桐子JcSUT3的cDNAPCR产物电泳图谱，其中1、2均为JcSUT3的cDNA PCR产物条带。 图3是小桐子JcSUT4的cDNAPCR产物电泳图谱，其中1、2均为JcSUT4的cDNA PCR产物条带。【具体实施方式】 下面结合实施例对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例 1 小桐子JcSUTl,JcSUT3,JcSUT4 的cDNA克隆。 1、小桐子RNA提取方法：使用OMEGA公司生产的植物RNA提取试剂盒。 (1)收集lOOmg冰本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小桐子蔗糖转运蛋白同源基因的克隆方法，其特征在于包括以下操作步骤：应用如SEQ ID NO：1所示的引物F，如SEQ ID NO：2所示的引物R，进行反转录PCR扩增JcSUT1；应用如SEQ ID NO：3所示的引物F，如SEQ ID NO：4所示的引物R，进行反转录PCR扩增JcSUT3；应用如SEQ ID NO：5所示的引物F，如SEQ ID NO：6所示的引物R，进行反转录PCR扩增JcSUT4。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：彭昌操，杨紫薇，刘思雯，韩鸿均，刘应波，任陈希，白雪，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44