编码人肝活素的基因、载体、转基因细胞和它们的应用及人肝活素的制备方法技术

本发明专利技术涉及生物工程领域，具体公开了一种编码人肝活素的基因，该基因具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。另外，本发明专利技术还公开了含有该基因的载体和转基因细胞，以及它们在制备用于预防和/或治疗肝损伤的药物中的应用，还涉及一种人肝活素的制备方法。本发明专利技术提供的新的编码HPS的基因，能够在宿主细胞中高效表达HPS，有效避免多聚体沉淀的形成，并且得到的HPS对肝损伤具有良好的疗效，如能够有效促进肝细胞的增殖、抗肝损伤、降低肝损伤组织转氨酶水平以及组织肝细胞坏死。

【技术实现步骤摘要】
编码人肝活素的基因、载体、转基因细胞和它们的应用及人肝活素的制备方法
本专利技术涉及生物工程领域，具体地，涉及一种编码人肝活素的基因，含有该基因的载体和转基因细胞，以及它们在制备用于预防和/或治疗肝损伤的药物中的应用，还涉及一种在细胞中，尤其是在哺乳动物细胞中以高水平产生人肝活素的方法。
技术介绍
我国是病毒性肝炎高发区，根据现有调查推算，我国有1.3亿人携带乙肝病毒，3800万人携带丙肝病毒，全国每年发生急性病毒性肝炎约120万例，每年死于肝病者约30万人。其中重症肝炎、急性肝功能衰竭等有着起病急、预后差、病死率高的特点，临床尚缺乏有效的治疗手段。“阻止肝细胞坏死，促进肝细胞再生”仍然是主要的治疗策略，其预后也主要取决于病损肝细胞的坏死程度和再生能力，这一原则后面的科学问题是肝损伤修复的分子机制。一些低等动物比如壁虎的尾、蝾螈的肢等，海参甚至全部的内脏都可以再生，但是高等动物尤其是哺乳动物组织再生能力非常有限，然而肝脏却是为数不多的具有强大再生能力的器官之一。肝脏至少承担着5000种以上的生理功能，是人体最重要的器官之一。虽然正常肝组织中处于有丝分裂状态的肝细胞仅占0.0012％-0.01％，但是肝脏的增殖能力和适应代谢变化需求的能力并未丧失。肝脏具有很强的损伤修复能力，当肝脏被部分切除或肝细胞受到破坏(如中毒、缺血、缺氧、病毒感染)时，剩余的肝细胞迅速进入分裂周期，通过强大的再生能力迅速修复损伤的肝组织，例如，鼠类在进行70％肝切除后在8-10天即可恢复正常肝脏大小。寻找阻止肝细胞坏死，促进肝细胞再生的药物一直是研究的热点，而基于肝再生的特点，从肝脏本身寻求治疗严重肝病的有效物质一直是人们梦寐以求的愿望，尤其是特异性的作用于肝脏的细胞增殖因子更是人们重点研究目标之一。早在七十年代LaBrecque等即报道在哺乳动物再生肝中存在一种特异性促肝增殖的细胞活性因子——肝细胞刺激物质(HepaticStimulatorySubstance，HSS)，随后研究表明该因子广泛存在于哺乳动物幼仔的肝、胚胎肝及再生肝组织中。80年代我国学者陈成伟等应用4-6月人胎肝细胞悬液(h-FLCS)治疗肝功能衰竭并获得较好疗效，从而推动了此项研究在国内的开展应用。肝损伤的修复机制十分复杂，细胞因子、生长因子、免疫系统、代谢网络等共同参与其中。肝脏受到损伤后，一方面表现为肝细胞的凋亡或坏死，机体在感知损伤后，相应的代谢、免疫等系统会发生相应的变化以适应新的情况；另一方面表现为肝细胞的增殖，损伤后，一些即刻早期基因(immediateearlygenes)如c-fos，c-jun等表达迅速升高，同时诱导枯否(氏)细胞、巨噬细胞等产生包括TNF-α在内的炎性细胞因子，进而激活产生NF-κB、IL-6、STAT3等，细胞由G0期进入G1期；此外，TNF-α还刺激产生TGF-α，协同其它生长因子比如HGF、EGF等促使细胞由G1期进入M期。在肝细胞增殖的过程中，细胞因子、生长因子起到关键的作用，它们通过相应的信号转导通路产生级联反应，相互作用，不仅启动而且维持肝的再生过程。目前已知能够促进肝细胞分裂的物质很多，主要包括两大类：细胞分裂素类和辅有丝分裂生长因子类，前者包括肝细胞生长因子(Hepatocytegrowthfactor，HGF)、肝细胞生成素(hepatopoietin，HPO)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF-α)等等，后者包括去甲肾上腺素(Norepinephrine)、雌激素(Estrogens)、胰岛素(Insulinum)和胰高血糖素(Glucagon)等。比如在肝再生过程中，HGF由肝非实质细胞合成分泌，作用于肝实质细胞膜上的特异受体c-Met而刺激肝细胞DNA合成，HGF和c-Met形成的旁分泌途径调控肝细胞的生长和分化；HPO在肝脏中存在自分泌循环，通过肝细胞表面的特异受体启动MAPK通路促进肝细胞的增殖；TGF-α以自分泌的形式为肝细胞提供促有丝分裂刺激物，而EGF则以内分泌的形式促进肝细胞的分裂。但上述各种生长因子对肝细胞的刺激作用都是非特异性的。以HGF为例，研究表明，HGF作用的靶细胞非常广泛，生物学作用多种多样如负向调控肿瘤细胞的增殖，促进非肝细胞再生与肾、胃、脑等组织损伤修复，正向调控造血，促进胚胎与多种器官发育，促进肾细胞等运动等。肝再生具有很强的器官特异性，寻找肝脏特异性的刺激因子对于深入认识肝再生的分子机制有重要意义，并可能为严重肝病治疗提供新药物。2000年，Hara等通过差减cDNA克隆和爪蟾卵母细胞表达筛选方法从大鼠肝脏中获得一种新的促肝细胞生长因子——Hepassocin(HPS，也称为人肝活素)。次年，人源性HPS也被克隆。序列检索表明人源性HPS与HFREP1(Hepatocyte-DerivedFibrinogen-RelatedProtein1)高度同源。HFREP1是FGL1基因表达产物，而FGL1(Fibrinogen-like1)是Yamamoto等于1993年通过差减杂交方法筛选到的一种基因，其表达产物HFREP1属于纤维蛋白原家族。纤维蛋白原和纤维蛋白原相关蛋白C端具有4个保守的半胱氨酸残基，HFREP1同纤维蛋白原β、γ的C末端同源——包含4个半胱氨酸，但缺少纤维蛋白凝血形成所必需的血小板结合位点、交联区和凝血酶敏感位点，故Yamamoto推测该蛋白是一种与血液凝固不相关的分泌蛋白。2002年，JunYAN等在小鼠中发现了鼠HPS的同源蛋白MFREP-1(mousefibrinogen-relatedprotein-1)，2004年，JunYAN等又获得了人LFIRE-1(liverfibrinogen-relatedgene－1)，而LFIRE-1是HPS和HFREP1的同源基因，因此JunYAN又将其命名为LFIRE-1/HFREP1基因，LFIRE-1/HFREP1基因与HFREP1基因具有相同的阅读框架(OpenReadingFrame，ORF)，只是在5’非翻译区有些不同，并且发现LFIRE-1/HFREP1是一种肝脏特异性表达的基因，该基因在肝癌细胞中表达下调同时还具有抑制肝癌细胞生长的特性。人Hepassocin基因位于染色体8p22-p21.3，由8个外显子组成，mRNA长度为1.2kb，ORF全长936bp，编码312个氨基酸的多肽，其中N末端22个氨基酸为其信号肽序列。人HPS多肽与HFREP1蛋白只有3个氨基酸位点的不同，即Asn69，Ile72，Leu105，而HFREP1则分别为Asp69，Val72，Pro105。鼠HPScDNA为1.4kb，蛋白多肽全长314个氨基酸，其中N末端24个氨基酸为其信号肽序列。人HPS与鼠HPS蛋白的同源性在切除信号肽前为81.4％，而切除信号肽后为83.8％。人HPS蛋白多肽单体为34kDa，内含有5个半胱氨酸残基，并且加入还原剂后HPS促肝增殖活性消失。Westernblot结果也显示HPS存在34kDa和68kDa两种天然形态，故此推测HPS在体内以同源二聚体的形式发挥作用。HPSmRNA在正常的大鼠肝脏中有低的表达，而当肝切除或D－氨基半乳糖做致损伤时，HPSmRNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种编码人肝活素的基因，其特征在于，该基因具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种编码人肝活素的基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQIDNo：1所示。2.一种重组载体，其特征在于，该重组载体含有权利要求1所述的基因和表达载体。3.一种转基因细胞，其特征在于，该转基因细胞含有权利要求1所述的基因。4.根据权利要求3所述的转基因细胞，其中，所述转基因细胞为真核细胞。5.权利要求1所述的编码人肝活素的基因、权利要求2所述的重组载体或权利要求3或4所述的转基因细胞在制备人肝活素中的应用。6.一种人肝活素的制备方法，其特征在于，该方法包括：在编码人肝活素的基因能够表达的条件下，培养权利要求3或...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨晓明，于淼，翟华立，吴帆，李长燕，詹轶群，陈慧，史世领，史世会，张全义，吕中原，王绪阳，
申请(专利权)人：北京正旦国际科技有限责任公司，中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所，河南新乡华星药厂，
类型：发明
国别省市：北京;11