本发明专利技术涉及一种转基因动物细胞CHO中抗体分子的轻重链基因拷贝数的定量检测方法，采用SYBR‑Green定量PCR方法，实现对抗体分子的轻链基因拷贝数和重链基因拷贝数进行定量、准确、高通量的检测。本发明专利技术的方法检测灵敏度高且线性范围宽、结果可靠，可用于研究抗体细胞株的稳定性，筛选出稳定的高表达的工程化细胞株。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学
，涉及一种转基因动物细胞中抗体分子的轻重链基因拷贝数的定量检测方法。
技术介绍
动物细胞已广泛地应用于生产各种生物活性物质如疫苗、生长因子、抗原、单克隆抗体等重组蛋白药物，这些动物细胞包括293细胞、Vero细胞、BHK细胞、PER.C6细胞、SP2/0细胞、NS0细胞、CHO细胞等，其中应用最为广泛的当属CHO细胞。经美国FDA批准的仅重组表达的抗体药物就达二十几种，每年创造的市场价值高达几百亿美元。随着基因工程技术的发展，越来越多的外源蛋白如抗体通过转基因的方法来获得。但是对于转基因细胞来说，外源基因是非内源性的物质，细胞在生长繁殖过程中，会产生外源基因丢失的情况，这就是基因的遗传稳定性。转基因细胞中普遍存在着基因不稳定的情况，对于工业化生产的细胞来说，特别是对于制药企业，细胞株的稳定性显得特别重要，其对于产品质量的稳定起到了非常重要的作用(Barnes LM等Biotechnol.Bioeng.,2003,81(6):631-9.)。所以非常有必要从分子水平、从遗传的角度来深入分析整合入细胞株的外源基因的稳定性。目前，研究外源基因的稳定性主要是通过检测基因拷贝数的变化来分析的(Chusainow J等，Biotechnol.Bioeng.,2009,102(4):1182-1196.)。基因拷贝数的检测目前常用Southern Blotting(Kaneko Y等，Journal of Bioscience and Bioengineering,2010,109(3):274–280)、Real-time PCR(Lattenmayer C等，J Biotechnol.2007,128(4):716-725)等方法，而采用Real-time PCR的方法可以省却了Southern Blotting方法的繁琐的步骤，可以简单快速准确地检测基因组的拷贝数。Real time PCR(实时PCR)又叫Q-PCR(quantitative PCR，定量PCR，实时定量PCR)，是指在PCR反应体系中加入荧光基团(如SYBR-Green、TaqMan荧光探针等)，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，最后通过荧光强度的变化来对未知模板进
行定量分析的方法。定量PCR按照荧光材料的不同，主要分为SYBR-Green定量PCR、TaqMan定量PCR方法。TaqMan定量PCR方法是在原有一对引物的基础之上，需要重新合成一条与正反向引物之间的靶序列相结合的特异性探针，荧光基团连接在探针的5'末端，而淬灭基团则在3'末端。当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3'端的淬灭基团接近而被淬灭；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和猝灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。在SYBR-Green为荧光染料的PCR反应体系中，加入过量SYBR-Green染料，SYBR-Green染料非特异性地掺入双链DNA而非单链DNA后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射荧光信号，从而保证荧光信号随着PCR产物的增加而同步增加。与TaqMan定量PCR方法相比较，SYBR-Green定量PCR方法具有使用简单，DNA染料较便宜，成本较低，不需要加入特异性探针，而且适用于任何序列，通用性好。在常规PCR扩增过程中，产物的累积一般遵循指数扩增的规律，Nn＝N0(1+e)n(Nn为扩增n轮后的产物量，N0为起始模板量，e为扩增效率，n为循环数)。但到PCR扩增后期，随着产物的不断增加，扩增产物已不再呈指数性增加，PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，根据最终PCR产物量无法计算出起始DNA拷贝数。而在定量PCR反应中，可以实时检测产物产生的荧光强度，在荧光信号呈指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，因此可以进行定量分析。在定量PCR过程中，每一个PCR样品都有一个Ct阈值(Cycle threshold value)，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数，一般而言，PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：Ct＝10×SDcycle(3-15)。大量数据研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。随着近几年基因组计划的研究进展，大量的物种基因组测序完成，包括人、小鼠、大鼠、中国仓鼠、食蟹猴、果蝇、线虫、牛、斑马鱼、恒河猴、家蚕、鸡、猩猩、山羊、猕猴、猪、马、熊猫等生物，相继阐明了基因组DNA的精确大小，则可推
算单位质量的细胞基因组中所含的DNA分子数，依据样品的起始拷贝数，进而可以绝对定量细胞中的外源基因的拷贝数量。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种检测转基因动物细胞中抗体分子重链基因拷贝数的定量检测方法，该方法中采用的重链基因正向引物为JRTH3和重链基因反向引物为JRTH3R，其中JRTH3的序列为：5'-CAAGCTGACCGTGGATAA-3'(如SEQ ID No.1所示)，JRTH3R的序列为：5'-GACAGGCTCTTCTGAGTG-3'(如SEQ ID No.2所示)。为了实现上述目的，本专利技术采用如下的步骤：a)合成针对抗体分子重链基因的特异性引物JHc-1F(如SEQ ID No.7所示的DNA分子)和JHc-1R(如SEQ ID No.8所示的DNA分子)，以完整抗体分子的重链DNA作为模板进行普通PCR扩增，制备出带有重链片段的质粒DNA，从而制备重链质粒DNA标准品。b)以JRTH3和JRTH3R为正向引物和反向引物、以步骤a)中的质粒DNA作为模板进行定量PCR反应，计算质粒DNA的拷贝数。从而建立标准曲线。c)提取转染抗体分子的动物细胞株的基因组DNA和未转染抗体分子的动物细胞株的基因组DNA作为模板，以JRTH3和JRTH3R为正向引物和反向引物，进行定量PCR反应，同时用无菌超纯水作为空白对照。定量PCR反应结束后进行溶解曲线的试验，获得Ct值，根据Ct值和步骤b)中的标准曲线计算动物细胞中抗体分子的重链基因拷贝数。上述步骤b)和c)中，在进行定量PCR扩增时，PCR反应的总体积是30μl：SYBR Green PCR Mix(SYBR Green PCR混合液)15μl；正向引物(10μM)0.5μl；反向引物(10μM)0.5μl；DNA模板10μl；无菌超纯水4μl。反应条件为95℃10min；95℃30s、60℃30s、72℃30s，共40个循环。上述的抗体如可以是人源化抗TNF-α单克隆抗体，还可以是人-鼠嵌合性抗TNF-α单克隆抗体，还可以是抗HER2人源化单克隆抗体，还可以是抗VEGF人源化单克隆抗体等等。本专利技术的第二个目的是提供一种检测转基因动物细胞中抗体分子轻链基因拷贝数的定量检测方法，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种SYBR‑Green定量PCR方法检测转基因细胞中抗体重链基因拷贝数的方法，其特征在于，所采用的正向引物和反向引物分别是SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的DNA分子。
【技术特征摘要】
1.一种SYBR-Green定量PCR方法检测转基因细胞中抗体重链基因拷贝数的方法，其特征在于，所采用的正向引物和反向引物分别是SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的DNA分子。2.如权利要求1所述的SYBR-Green定量PCR方法检测转基因细胞中重链基因拷贝数的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：a)合成针对抗体重链基因的特异性正向引物JHc-1F和特异性反向引物JHc-1R，以完整抗体的重链DNA作为模板进行普通PCR扩增，制备出带有重链片段的质粒DNA，从而制备重链质粒DNA标准品；所述JHc-1F的序列如SEQ ID No.7，所述JHc-1R的序列如SEQ ID No.8所示；b)以SEQ ID No.1所示的正向引物和SEQ ID No.2所示的反向引物、以步骤a)中的带有重链片段的质粒DNA标准品作为模板进行定量PCR反应，计算质粒DNA的拷贝数，建立PCR反应标准曲线；c)提取转染抗体分子的动物细胞株的基因组DNA和未转染抗体分子的动物细胞株的基因组DNA作为模板，采用SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的正向引物和反应引物，进行定量PCR反应，同时用无菌超纯水作为空白对照；定量PCR反应结束后获得Ct值，并进行溶解曲线的试验，根据Ct值和步骤b)中的标准曲线计算动物细胞中抗体分子的重链基因拷贝数；上述步骤b)和c)中，在进行定量PCR扩增时，其定量PCR反应的总体积是30μl：SYBR Green PCR Mix 15μl，10μM浓度的正向引物0.5μl，10μM浓度的反向引物0.5μl，DNA模板10μl，无菌超纯水，4μl；其定量PCR反应条件为：先95℃10min，随后依次95℃30s、60℃30s、72℃30s，共40个循环。3.如权利要求1或2所述的SYBR-Green定量PCR方法检测转基因细胞中重链基因拷贝数的方法，其特征在于，所述转基因细胞选自CHO细胞。4.一种SYBR-Green定量PCR方法检测转基因细胞中抗体分子轻链基因拷贝数的方法，其特征在于，所采用的轻链基因引物为SEQ I...
【专利技术属性】
技术研发人员：薛建华，黄雪怡，徐水清，
申请(专利权)人：嘉和生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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