一种生物大分子上游分阶段截留的生产方法、生产模块及在生产中的应用技术

本发明专利技术提供了一种生物大分子上游生产过程中分阶段截留的生产方法、配合该方法使用的生产模块以及该方法/模块在工业化生产多肽、融合蛋白以及免疫球蛋白分子上的应用。本发明专利技术的方法可以有效地实现大规模重组蛋白上游工艺的效率、产量和纯度的提高。

A Stage-by-Stage Interception Production Method, Module and Application in the Production of Bio-macromolecule Upstream

【技术实现步骤摘要】
一种生物大分子上游分阶段截留的生产方法、生产模块及在生产中的应用
本专利技术属于生物制品生产领域，更具体地，涉及到生物大分子的工业化生产，特别是多肽、融合蛋白或免疫球蛋白的上游工艺制备。
技术介绍
生物大分子，特别是融合蛋白与免疫球蛋白分子是当今生物制药领域的热点，其生产需要经过细胞培养的上游工艺制备，再从细胞培养液中获得、纯化、精制、浓缩的下游工艺制备过程，以及将抗体分子置于适于人体的制剂溶液的制剂工艺制备三个主要步骤。在上游工艺中用于生产重组蛋白的表达体系主要是建立在哺乳动物细胞培养体系中，一般从工作细胞库的单个储存管的细胞活化开始，经过三角瓶，2升，10升，50升，然后到500升的细胞反应器生产。由于细胞培养过程中所涉及的培养基成分多达70-80种，且在细胞培养过程中还可能在细胞反应其中积累分泌的蛋白酶类、小的细胞碎片及宿主细胞蛋白、DNA、RNA分子等多种杂质。同时，还包括残缺的抗体分子或者由于氧化还原造成电荷分布不一样的抗体分子等，因此下游工艺中需要使用离心法和深层过滤去除细胞后，再用蛋白A亲和层析法完成抗体的收获，这一步骤的产品收率大于95％，但此时不仅收获了绝大多数带有Fc片段的完整抗体分子，还同时将残缺的抗体分子等和产品性质相关的杂质一并收获从而导致在其后的纯化和精制步骤中操作难度很大。因此，在这样的情况下，为了保证产品的高质量，或者不同生产批次的相似性，下游工艺的纯化和精制步骤往往是以牺牲产率作为结果的。现有的生物大分子的大规模工业生产的上游细胞培养阶段常采用灌注培养(perfusionculture)与分批补料培养(fed-batchculture)两种形式，再结合不同的细胞截留工艺，以实现高密度的细胞培养，同时达到细胞培养液中杂质的过滤。ATF技术(AlternatingTangentialFlowFiltration，交替切向流过滤)是一种最先进的截留工艺，这是一种保证对细胞低剪切力、较大的过滤面积且强的抗堵塞能力的过滤系统，可以实现高密度的细胞过滤培养。然而，在实际操作过程中，由于细胞的不断生长，会在细胞大规模培养过程中累积产生除了表达蛋白之外的不同性质的代谢产物或产品相关杂质，如在细胞培养的初期主要在培养基中累积细胞代谢产物，同时在细胞大量扩展初期的培养条件下，会在培养基中产生少量的抗体产物，这部分的抗体产物易于受初期培养温度较高等条件影响，发生脱氨或降解等变化，成为产品相关物质或杂质。这些代谢产物和产品相关杂质随着细胞与期望蛋白的浓度升高，将会直接影响最终蛋白产物的产量和纯度，更将影响蛋白产物的天然构象，可能造成高浓度蛋白的相互聚集，造成企业后期处理重大的成本和时间上投入，乃至不可挽回的损失。因此，现有生物大分子在上游生产工艺中的局限使得企业中难以在短时间内按时间表实现高质量，高速度和高产出转化为产品，故亟待寻求一种生产解决方案，用于克服在上游生产阶段细胞培养过程中的代谢产物和产品相关杂质对生产的影响问题。
技术实现思路
本专利技术提供了一种生物大分子上游生产过程中分阶段截留的生产方法、配合该方法使用的生产模块以及该方法/模块在工业化生产多肽、融合蛋白以及免疫球蛋白分子上的应用，利用该方法，可以有效地实现大规模重组蛋白上游工艺的效率、产量和纯度的提高。本专利技术的第一方面，提供了一种生物大分子上游分阶段截留的生产方法，包括使用生物反应器结合截留系统的生产方式，所述方法至少包含两个生产阶段，在第一生产阶段，使用包含第一过滤模块的截留系统，所述的第一过滤模块包含有滤孔为0.05μm-1μm的过滤组件；在第二生产阶段，使用包含有第二过滤模块的截留系统，所述的第二过滤模块包含有滤孔的截留分子量相对于产物分子量1/15～2/3过滤组件。在一优选实施例中，所述的第一过滤模块包含有滤孔为0.1μm-0.5μm，优选地为0.2μm-0.3μm的过滤组件。在一优选实施例中，所述的第二过滤模块包含有滤孔的截留分子量相对于产物分子量的2/15～7/15，优选地1/5～1/3的过滤组件。在一优选实施例中，所述产物的分子量为50～300KD；优选地，所述产物的分子量为100～250KD；更优地，所述的产物分子量在150～200KD。所述的第一生产阶段为细胞的初始增殖阶段，或可称为产物合成优化阶段。由于初始环境中培养温度较高(37℃)，细胞处于高速增殖阶段，大量的细胞代谢废物、乳酸产物以及少量脱氨或降解的抗体杂质容易累积。所述的第二生产阶段为产物合成与收集阶段，本专利技术人意外发现，在清除了第一生产阶段中产生的代谢产物和杂质后，更有利于第二生产阶段高质量产物的合成和收集，因此，创造性地引入了分阶段截留体系，以期提高后期产物的质量和产率。在一优选实施例中，第一生产阶段中，所述的截留系统主要截留细胞，去除代谢产物及杂质；第二生产阶段中，所述的截留系统主要截留细胞且富集蛋白产物，去除小分子代谢产物。在一实施例中,在生物大分子上游生产中，第一生产阶段可以在细胞接种到生物反应器后就开始启动。在另一实施例中，在生物大分子上游生产中，细胞培养密度达到6±1.5×106细胞数/毫升时，启动第一生产阶段。在另一实施例中，在生物大分子上游生产中，细胞培养密度达到10±5×106细胞数/毫升时，启动第一生产阶段。在一实施例中，所述的第二生产阶段的细胞培养密度不低于15±5×106细胞数/毫升；优选地，所述的第二生产阶段的细胞密度不低于35±5×106细胞数/毫升。在另一优选例中，所述的“培养密度不低于15±5×106细胞数/毫升”为培养密度10×106～30×106细胞数/毫升。在另一优选例中，所述的“培养密度不低于35±5×106细胞数/毫升”为培养密度30×106～50×106细胞数/毫升。在另一优选例中，所述的“培养密度不低于15±5×106细胞数/毫升”为培养密度10×106～300×106细胞数/毫升，直至培养到细胞活率下降到50％时，收获细胞发酵液，完成第二生产阶段；优选地，培养细胞的活力下降到70％时，收获细胞发酵液；更优地，培养细胞的活力下降到80％时，收获细胞发酵液；最优地，培养细胞的活力下降到90％时，收获细胞发酵液。在另一优选例中，所述的“培养密度不低于35±5×106细胞数/毫升”为培养密度30×106～100×106细胞数/毫升。在一实施例中，所述的第二生产阶段的细胞培养密度呈现相对稳定的趋势，其波动范围不高于10×106细胞数/毫升。在另一实施例中，所述的第二生产阶段的细胞培养密度呈递增趋势，其波动范围高于10×106细胞数/毫升。在另一实施例中，所述的“波动范围高于10×106细胞数/毫升”为波动范围10×106～290×106细胞数/毫升。在另一优选实施例中，所述的“波动范围高于10×106细胞数/毫升”为波动范围10×106～90×106细胞数/毫升。在一实施例中，所述的截留系统包括但不限于交替式切向流系统、切向流过滤系统、旋转过滤系统、深层过滤系统、离心机系统或沉降系统。在一实施例中，所述的生物反应器包括但不限于气升式生物反应器、机械搅拌式生物反应器、鼓泡塔式生物反应器、膜生物反应器。在另一实施例中，所述的生物反应器包括但不限于孵化摇床式、微型生物反应器、台式生物反应器、不锈钢生物反应器、玻本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生物大分子上游分阶段截留的生产方法，包括使用生物反应器结合截留系统的生产方式，其特征在于，所述方法包含以下生产阶段：第一生产阶段，使用包含第一过滤模块的截留系统，所述的第一过滤模块包含有滤孔为0.05μm‑1μm的过滤组件；第二生产阶段，使用包含有第二过滤模块的截留系统，所述的第二过滤模块包含有滤孔的截留分子量相对于产物分子量1/15～2/3的过滤组件。

【技术特征摘要】
1.一种生物大分子上游分阶段截留的生产方法，包括使用生物反应器结合截留系统的生产方式，其特征在于，所述方法包含以下生产阶段：第一生产阶段，使用包含第一过滤模块的截留系统，所述的第一过滤模块包含有滤孔为0.05μm-1μm的过滤组件；第二生产阶段，使用包含有第二过滤模块的截留系统，所述的第二过滤模块包含有滤孔的截留分子量相对于产物分子量1/15～2/3的过滤组件。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一过滤模块包含有滤孔为0.1μm-0.5μm，优选地为0.2μm-0.3μm的过滤组件；和/或所述的第二过滤模块包含有滤孔的截留分子量相对于产物分子量的2/15～7/15，优选地1/5～1/3的过滤组件。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述产物的分子量为50～300KD；优选地，所述产物的分子量为100～250KD；更优地，所述的产物分子量在150～200KD。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第二生产阶段的细胞培养密度不低于15±5×106细胞数/毫升；优选地，所述的第二生产阶段的细胞密度不低于35±5×106细胞数/毫升。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的第二生产阶段的细胞培养密度的波动范围不高于10×106细胞数/毫升或所述的第二生产阶段的细胞培养密度呈递增趋势，其波动范围高于10×106细胞数/毫升。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的截留系统选自交替式切向流系统、切向流过滤系统、旋转过滤系统、深层过滤系统、离...

【专利技术属性】
技术研发人员：周新华，李子财，徐水清，阚子义，林军，段清堂，王建清，安明岩，李民珠，
申请(专利权)人：嘉和生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31