一种用于前列腺癌治疗评估的联合基因标志物及其检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了可以用于对前列腺癌化疗过程中耐药性进行预评估的分子标记物组合，该分子标记物是由2个前列腺癌敏感基因(P53基因、GSTP1基因)和1个miRNA(miRNA‑155)所组成，可以应用于对化疗耐药性的评估；同时，本发明专利技术还提供了应用于评估的引物组和试剂盒；本发明专利技术还提供了上述引物组和试剂盒在分子标记表达量的联合判别方程中的应用。通过评估上述基因的相对表达量，可以较好地对多西他赛和泼尼松联合治疗前列腺癌中存在的耐药性进行评估。

【技术实现步骤摘要】
一种用于前列腺癌治疗评估的联合基因标志物及其检测试剂盒
本专利技术属于前列腺癌治疗与诊断
，特别涉及一种用于对前列腺癌化疗效果和耐药性评估的基因联合标志物，以及由该联合标志物制备得到的检测试剂盒。
技术介绍
近年来，我国前列腺癌发病率显著升高。与西方国家前列腺癌患者分期构成不同，我国近70%的前列腺癌患者初诊时就已是晚期转移患者。虽然绝大多数患者对内分泌治疗敏感，但几乎所有患者在治疗18个月后会进展至激素抵抗性前列腺癌(HRPC)，患者生存期一般不超过2年。2004年TAX327和SWOC-9916两项研究结果表明，多西他赛为基础的化疗较米托蒽醌能显著延长HRPC患者的总体生存期，一举奠定了其作为HRPC一线治疗药物的地位。但是，在临床上仍然有患者出现多西他塞治疗效果不佳的问题，因此，预先对与多西他塞治疗耐药相关情况进行评估具有重要意义。miRNA是新近证明的一类高度保守的、内源性非编码的小分子RNA，在转录后水平调节基因的表达。最近的研究表明miRNA参与各种各样的调节通路，包括生长发育、细胞增殖和凋亡、信号传导等一系列重要的生命调节过程。已发现miRNA的表达异常可能导致人类多种疾病，如癌症、自身免疫性疾病及肾脏疾病等。研究显示miRNA参与调控人体细胞中细胞代谢、增值、分化、凋亡、免疫等过程；它的异常表达在疾病的发生发展中起了关键性作用。研究显示miRNA在病理发展中会快速从组织中释放入血，在血清、血浆、唾液和尿液中，这些胞外miRNA与肿瘤的不同病理状态有关。Weber等钉检测了12种来自于不同阶段怀孕妇女和不同泌尿道上皮细胞肿瘤患者的体液和尿液标本中的miRNA，应用定量PCR对这些体液中的miRNA做广谱分析。结果显示miRNA在所有体液中均存在，在不同体液中构成比明显不同，一些高水平的miRNA在多种体液中表达相同，而一些miRNA在特定体液中富集，还观察到不同生理状态的尿液标本具有独特的miRNA模式。提示使用特定miR-NA水平可用作检测和监测不同病理生理学状态。尿液中蕴藏着大量生物学信息且具有无创收集、标本处理相对简便的优势，检测尿液中RNA类的肿瘤标志物还可以用于诊断其他泌尿系统的实体肿瘤，而且这类循环miRNA的独特表达模式与特定的疾病相关，特别是早期阶段，其高特异性和敏感性的潜能可用于肿瘤分期和早期预测引。Bryant等使用含有742个miRNA的qRT-PCR芯片分析了78例前列腺癌患者和28例健康对照血清标本，确定了12个表达量差异的miRNA。进而检测135份健康人与前列癌患者尿液标本中5个选定的miRNA，发现肿瘤患者尿液中miR-107和miR-574-3p水平显著高于健康对照，均可诊断出前列腺癌患者，并且准确性高于检测尿液前列腺特异性抗原(PSA)。利用miRNA对多西他赛治疗HRPC耐药性能进行判断目前尚无研究。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了可以用于对前列腺癌化疗过程中耐药性进行预评估的分子标记物组合，该分子标记物是由2个前列腺癌敏感基因(P53基因、GSTP1基因)和1个miRNA(miRNA-155)所组成，可以应用于对化疗耐药性的评估；同时，本专利技术还提供了应用于评估的引物组和试剂盒；本专利技术还提供了上述引物组和试剂盒在分子标记表达量的联合判别方程（联合标志物）中的应用。本专利技术的第一个方面：一种用于激素抵抗性前列腺癌化疗耐药效果评估的联合标记物，包括有P53基因、GSTP1基因和miRNA-155，以及内参基因U6和GAPDH。所述的化疗是指多西他赛和泼尼松联合治疗。本专利技术的第二个方面：一种用于对上述联合标记物进行检测的试剂。所述的试剂，是用于对联合标记物的表达量进行检测的试剂。所述的试剂中包括有：用于扩增P53基因的引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO.1～2所示；用于扩增GSTP1基因的引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO.5～6所示；用于miRNA-155反转录的引物，其核苷酸序列如SEQIDNO.34所示；用于扩增miRNA-155反转录cDNA的引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO.35～36所示；用于扩增内参基因U6的引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO.37～38所示；用于扩增内参基因GAPDH的引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO.39～40所示。包括有上述试剂的试剂盒。上述的试剂在制备激素抵抗性前列腺癌化疗耐药效果评估用试剂盒中的应用。所述的应用，是指评估以下算式F的值是否大于3.2：F1=((-Ln(miR-155相对于U6的表达量))-0.5+0.71)×(Ln(TP53相对于GAPDH的表达量)+0.24)-0.52×Ln(GSTP1相对于GAPDH的表达量)；当F的值大于3.2时，认为存在耐药风险。有益效果本专利技术提供了可以用于对前列腺癌化疗过程中耐药性进行预评估的分子标记物组合，该分子标记物是由2个前列腺癌敏感基因(P53基因、GSTP1基因)和1个miRNA(miRNA-155)所组成，可以应用于对化疗耐药性的评估；同时，本专利技术还提供了应用于评估的引物组和试剂盒；本专利技术还提供了上述引物组和试剂盒在分子标记表达量的联合判别方程中的应用。通过评估上述基因的相对表达量，可以较好地对多西他赛和泼尼松联合治疗前列腺癌中存在的耐药性进行评估。附图说明图1是公式1作为联合标记进行耐药判断的特异性和敏感性的ROC图；图2是公式2作为联合标记进行耐药判断的特异性和敏感性的ROC图；图3是公式3作为联合标记进行耐药判断的特异性和敏感性的ROC图。具体实施方式下面通过具体实施方式结合附图对本专利技术作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1我们选择了以下3个可能与前列腺癌相关的敏感基因以及10个与肿瘤发病相关的miRNA基因，对其与前列腺癌耐药的相关性进行分析。基因如下：使用荧光定量PCR对上述基因和miRNA的表达量进行检测，首先通过尿沉渣中提取RNA，再转录为cDNA之后，进行qPCR分析；采用的内参基因为U6和GAPDH，分别将基因和miRNA相对于它们的表达量进行对比，统计计算基因和miRNA的相对表达量。其中，对于上述3个基因的cDNA扩增所采用的引物对如下：其中，对miRNA进行反转录的过程采用环茎法，使用的反转录引物以及对cDNA进行扩增使用的引物如下：其中，对于内参基因U6和GAPDH的扩增引物序列如下：实施例1尿液中RNA的提取、反转录和荧光定量PCRl、取前列腺按摩后的前段尿液20～30ml，立即放入冰水中冷却。于4℃、3000r/min下离心10min收集尿沉渣，加等量冷D-hanks液洗涤2次。2、将尿沉渣收集至1.5mlEppendorf管中，即加含酸性异硫氰酸胍的变性液500μl混匀置-70℃保存。3、按照经典总RNA抽提试剂盒说明提取总RNA后真空干燥，用15μlDEPC水溶液。4、取2μlRNA溶液加98μl本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于激素抵抗性前列腺癌化疗耐药效果评估的联合标记物，其特征在于，包括有P53基因、GSTP1基因和miRNA‑155，以及内参基因U6和GAPDH。

【技术特征摘要】
1.一种用于激素抵抗性前列腺癌化疗耐药效果评估的联合标记物，其特征在于，包括有P53基因、GSTP1基因和miRNA-155，以及内参基因U6和GAPDH。2.根据权利要求1所述的用于激素抵抗性前列腺癌化疗耐药效果评估的联合标记物，其特征在于，所述的化疗是指多西他赛和泼尼松联合治疗。3.用于对权利要求1所述的联合标记物进行检测的试剂。4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，是指用于对联合标记物的表达量进行检测的试剂。5.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述的试剂中包括有：用于扩增P53基因的引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO.1～2所示；用于扩增GSTP1基因的引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO.5～6所示；用于miRNA-155反转录的引物，其核苷酸序列如SEQIDNO...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆雯，
申请(专利权)人：毛强平，
类型：发明
国别省市：江苏,32