一种运用分子信标‑熔解曲线技术鉴定细菌的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于快速鉴定多种临床常见细菌的分子信标及试剂盒，属于微生物检测技术领域。本发明专利技术提供的分子信标序列SEQ ID.：v6p1、v6p2、v1p1、v1r所示，通过在NCBI的基因序列库中比对多种临床常见细菌16s核糖体RNA序列，在标签序列处设计分子信标，能够对临床常见的18种细菌，1种鲍曼不动杆菌、嗜水汽单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌、弗氏柠檬酸杆菌、阴沟肠杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌、产气肠杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、单增李斯特菌、奇异变形菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、金色葡萄球菌、沙门氏菌、粘质沙雷菌、噬麦芽窄食单胞菌进行快速鉴定。本发明专利技术还公开了包含上述分子信标的检测多种细菌的试剂盒，能快速、准确鉴定多种临床常见细菌。

【技术实现步骤摘要】
一种运用分子信标-熔解曲线技术鉴定细菌的试剂盒及其应用
本专利技术属于细菌检测
，具体涉及细菌快速鉴定试剂盒(分子信标法)；还涉及所述试剂盒中使用的对于细菌16s核糖体RNA具有部分特异性的分子信标探针。
技术介绍
病原菌的鉴定一直是临床微生物室工作的难点和重点之一。目前临床上广泛采用细菌分离培养、形态特征、生化反应以及免疫学等方法对病原菌进行分类鉴定，但这些方法均存在耗时长、特异性差、操作繁琐等问题，越来越难以满足现代细菌学研究的发展要求。虽然全自动微生物分析系统(AMS)在大型医院已经普及，但其耗材昂贵，耗时仍相对较长。16s核糖体RNA，简称16srRNA，是原核生物的核糖体30s亚基的组成部分，16srRNA的3′端具有能与mRNA上游AUG起始密码子结合的Shine-Dalgarno序列，同时也可作为核糖体蛋白质结合的架构。由于不同种的细菌和古细菌间的16srRNA基因是高度保守的，因此16srRNA常备用于对各种生物进行的系统发生学方面的研究。16srRNA中同时具有保守的引物结合位点和高变区(签名序列)。近年来，随着微生物遗传信息数据库的不断完善，16srRNA已经成为临床微生物学中可用来替代细菌表型的另一种鉴定目标。将细菌分离培养与PCR及杂交探针、基因芯片等技术手段相结合,具有敏感度高、重复性好等优点,但需经过PCR扩增，PCR扩增耗时长，且其高灵敏度容易因轻微污染而产生假阳性，扩增后产物所产生的气溶胶等污染也是一个不容忽视的问题。16srRNA鉴定方法基于一种高分辨熔解曲线技术(Highresolutionmeltingcurveanalysis)的临床细菌的快速检测技术，通过分子信标对于从细菌中提取出的16srRNA模板的杂交—解链分析二者间的碱基互补程度，16srRNA上的单个碱基差异都会使熔解温度(MT)发生浮动，但是由于MT值同时会受到目标序列GC含量及碱基排列的影响。因此分子信标-熔解曲线技术尚未被用于临床细菌鉴定领域。
技术实现思路
本专利技术需要解决的技术问题是提供细菌鉴定用分子信标探针。本专利技术还要解决的技术问题是提供一种运用分子信标-熔解曲线技术鉴定细菌的试剂盒。本专利技术最后要解决的问题是提供上述试剂盒在细菌检测中的应用。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：一种细菌鉴定用分子信标，包括如下分子信标探针；分子信标探针v6p1：5′-FAM-CGGCGGCTCTAGCGTTGTCAAAGGATGTCAAGCTTTGGTAAGGTTCCCGCCG-DAB-3′；分子信标探针v6p2：5′-FAM-CGCGGGCAGCAAGCTGCTGCCTGTTACCGTTCGACTTGCACCGCG-DAB-3′；分子信标探针v1p1：5′-Hex-GGCGGCGCTTCTCGACCGAGGCTCGACTTGCATGTATTAGGGCCGCC-DAB-3′；分子信标探针v1r：5′-Cy5-GCGCGGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAACGCACGGGGAGCTTGCCCGCGC-DAB-3′。使用4种不同序列、长度及荧光标记的分子信标探针，能够一次生成一组由4个MT值构成的数据，使得即便具有较高同源性的菌种也能得以区分。分子信标探针v6p1的5’端和3’端的6个碱基是形成探针特征性发夹结构茎端区的反向互补序列，探针分子中间的39个碱基是与细菌核糖体RNA16s高变区部分互补的序列。分子信标探针v6p2的5’端和3’端的6个碱基是形成探针特征性发夹结构茎端区的反向互补序列，探针分子中间的45个碱基是与细菌核糖体RNA16s高变区部分互补的序列。分子信标探针v1p1的5’端和3’端的6个碱基是形成探针特征性发夹结构茎端区的反向互补序列，探针分子中间的48个碱基是与细菌核糖体RNA16s高变区部分互补的序列。分子信标探针v1r的5’端和3’端的6个碱基是形成探针特征性发夹结构茎端区的反向互补序列，探针分子中间的52个碱基是与细菌核糖体RNA16s高变区部分互补的序列。运用分子信标-熔解曲线技术鉴定细菌的试剂盒，该试剂盒包括权利要求1所述的分子信标探针混合液和2×杂交反应液。其中，所述2×杂交反应液包括如下组分：甜菜碱0.25～0.5M、DMSO1～2％(V/V)、Tris-HCl50～100mM、氯化钾100～500mM、氯化镁50～100mM；优选甜菜碱0.4M、DMSO1.5％(V/V)、Tris-HCl80mM、氯化钾200mM、氯化镁80mM。其中，所述分子信标探针混合液中，各分子信标探针的浓度如下：分子信标探针v6p1浓度为0.5～1.0OD，分子信标探针v6p2浓度为0.5～1.0OD，分子信标探针v1p1浓度为0.25～0.5OD，分子信标探针v1r浓度为0.25～0.5OD；优选分子信标探针v6p1浓度为0.625OD，分子信标探针v6p2浓度为0.625OD，分子信标探针v1p1浓度为0.3125OD，分子信标探针v1r浓度为0.3125OD作为优选，该试剂盒包括阳性对照和空白对照。其中，所述阳性对照为大肠杆菌CICC10421＝078:K80菌株中纯化得的核酸。其中，所述空白对照为水。本专利技术通过提供一组对细菌16srRNA具有部分特异性的分子信标探针及包含上述分子信标探针的试剂盒，来鉴定经培养基分纯培养后的菌落。有益效果：本专利技术所述的试剂盒具有以下优点：(1)无需PCR扩增，直接对提取好的核酸模板进行Tm值分析，在极短的时间内即可完成检测，同时避免了PCR产物污染的风险，不易因污染产生误判；(2)不含酶，提升了试剂盒的稳定性，并降低了检测成本；(3)覆盖范围大：本试剂盒可对18种细菌进行鉴定，覆盖了临床感染中最常见的阴性杆菌和阳性球菌；(4)实时检测：获得Tm值数据组后马上可以分析数据获得检测结果。附图说明图118种细菌在Fam荧光通道中的熔解峰。图218种细菌在Hex荧光通道中的熔解峰。图318种细菌在Cy5荧光通道中的熔解峰。图4甜菜碱浓度对熔解峰分辨率的影响。图5鲍曼不动杆菌Cy5通道TM值范围的建立。图中英文字母对应的中文名称为：Fluorescence荧光值；Temperature温度，Meltingpeaks熔解峰。具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本专利技术。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本专利技术，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本专利技术。实施例1：分子信标探针的设计。(1)从美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库下载本专利技术所述试剂盒可鉴定的18种临床感染常见细菌16s-rDNA的序列信息作为分子信标探针设计的依据；18种临床感染常见细菌包括如下细菌：鲍曼不动杆菌、嗜水汽单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌、弗氏柠檬酸杆菌、阴沟肠杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌、产气肠杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、单增李斯特菌、奇异变形菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、金色葡萄球菌、沙门氏菌、粘质沙雷菌、噬麦芽窄食单胞菌。(2)设计分子信标探针，原则为：①使其覆盖16s-rRNA上的部分保守区序列和部分高变区序列；②使其与本专利技术所述试剂盒可鉴定的18种临床感染常见细菌的16s-rRNA目标序列有不同的互补程度；③每个分子信本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细菌鉴定用分子信标探针，其特征在于，包括如下分子信标探针；分子信标探针v6p1：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；分子信标探针v6p2：其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；分子信标探针v1p1：其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；分子信标探针v1r：其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

【技术特征摘要】
1.一种细菌鉴定用分子信标探针，其特征在于，包括如下分子信标探针；分子信标探针v6p1：其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；分子信标探针v6p2：其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；分子信标探针v1p1：其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；分子信标探针v1r：其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。2.根据权利要求1所述的细菌鉴定用分子信标探针，其特征在于，分子信标探针v6p2寡核苷酸DNA分子的5′端标记荧光报告基团FAM，3′端标记荧光淬灭基团DABCYL。3.根据权利要求1所述的细菌鉴定用分子信标探针，其特征在于，分子信标探针v6p2寡核苷酸DNA分子的5′端标记荧光报告基团FAM，3′端标记荧光淬灭基团DABCYL。4.根据权利要求1所述的细菌鉴定用分子信标探针，其特征在于，分子信标探针v1p1寡核苷酸DNA分子的5′端标记荧光报告基团HEX，3′端标记荧光淬灭基团DABCYL。5.根据权利要求1所述的细菌鉴定用分子信标探针，其特征在于，分子信标探针v1r在寡核苷酸DNA分子的5′端标记荧光报告基团CY5，3′端标记荧光淬灭基团DABCYL6.运用...

【专利技术属性】
技术研发人员：任绪义，吕江峰，周静，
申请(专利权)人：杭州迪安生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33