本发明专利技术公开了一种NAT2基因多态性荧光PCR熔解曲线检测试剂盒，包括一第一探针、一第二探针、一第三探针、一第四探针、一正向引物和一反向引物，第一探针、第二探针、第三探针和第四探针的5’端分别标记有不同的荧光基团，3’端均标记有相应的淬灭基团。本发明专利技术在单管PCR体系中即可完成4个位点4个单核苷酸多态性的检测，PCR扩增结束经一次荧光PCR熔解曲线分析就可知道样本基因型，整个操作在3小时即可完成，耗时短。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种NAT2基因多态性荧光PCR熔解曲线检测试剂盒。
技术介绍
结核病是由于结核分枝杆菌感染引起的疾病，在全世界范围内都是困扰着人类健康的严重问题。结核分枝杆菌可以通过空气传播，目前全球约有20亿人感染了结核分枝杆菌，若不及时治疗，平均每例结核病患者每年可传染10～15人。结核病是导致死亡人数最多的感染性疾病之一，全球每年新出现的肺结核患者约800～1000万例，每年因肺结核死亡的人数约200～300万例，其中95％的结核病患者及98％的结核病死亡患者发生在发展中国家。异烟肼(isoniazid，INH)自1952年被用于临床治疗以来，因其成本低廉且具有强大的杀菌能力，一直被广泛用作抗结核治疗的一线药物，但由其引发的不良反应也不可忽视。INH可引发的严重不良反应包括高烧、外周神经炎和肝毒性反应等，其中肝毒性反应最常发生，发生率在1～36％之间不等，且有一定的致死率。在所有的一线抗结核药物中，异烟肼是引发肝毒性不良反应的主要药物。INH在人体内主要存在两条代谢通路，其大部分(50～90％)在N-乙酰基转移酶2(N-acetyltransferase-2，NAT2)的作用下乙酰化为乙酰异烟肼(AcINH)，之后在酰胺酶(amidase)的作用下生成乙酰烟肼(acetylhydrazine，AcHz)，另外一小部分直接由酰胺酶催化水解为酰肼(hydrazine，Hz)，Hz是构成INH肝毒性的主要物质。N-乙酰基转移酶2由NAT2基因编码，其基因的多态性会造成个体间N-乙酰基转移酶2活性的差异，由此可将人群的乙酰化代谢表型分为快代谢(rapidmetabolizer，RM)、中间代谢(intermediatemetabolizer，IM)和慢代谢(slowmetabolizer，SM)三种类型。对于IM和SM的结核病患者，由于INH的乙酰化作用减弱，水解作用反而加强，导致大量Hz积累，最终引起肝功能受损。NAT2基因定位于人类8号染色体8p22，编码区全长820bp，共编码290个氨基酸，研究证实NAT2基因突变可影响NAT2酶的表达、稳定性以及催化活性。NAT2基因主要存在7个常见的单核苷酸多态性位点，分别是191G＞A、282C＞T、341T＞C、481C＞T、590G＞A、803G＞A、857G＞A，可组成27个以上的等位基因型，其中*4型为野生型，为正常的快代谢等位基因。481位点单独突变时不会导致氨基酸的变化，形成快代谢等位基因*11；282位点通常与590或857位点联合突变，形成等位基因*6A和*7B；341、481、803位点联合突变形成等位基因*5B。*5B、*6A、*7B是中国和高加索人中最常见的慢乙酰化表型突变，占所有突变的90％以上，它们是造成NAT2基因多态性的主要原因，可解释98％以上的SA，其乙酰化活性顺序为*4＞*7B＞*6A＞*5B。中国人群中*5B、*6A、*7B的基因频率分别为3.3％、21.2％、11.7％(合计36.2％)，突变纯合子的发生率为15.8％。根据携带的等位基因型对乙酰化表型进行划分，携带两个快代谢等位基因为快代谢型RM，携带一个快代谢等位基因和一个慢代谢等位基因为中间代谢型IM，携带任意两个慢代谢等位基因为慢代谢型SM。据文献报道，SM与INH引发的肝毒性不良反应密切相关。Meta-分析数据显示，SM患者发生肝毒性不良反应的总体OR值为3.10(95％CI：2.47-3.88，P＜10-5)，但不同种族间差异较大，如在东亚人群(OR＝3.24，95％CI：2.38-4.41，P＜10-5)、南亚人群(OR＝2.96，95％CI：1.83-4.76，P＜10-5)、亚洲中部人群(OR＝6.20，95％CI：3.11-12.33，P＜10-5)和巴西人群(OR＝3.52，95％CI：1.99-6.24，P＜10-5)中，SM和肝毒性不良反应存在强烈的相关性，而在高加索人群中(OR＝1.44，95％CI：0.82-2.52，P＝0.20)，则未发现二者之间的关联。目前有大量基于NAT2基因型的INH剂量研究[19，20，21]，大多建议IM患者使用标准剂量；RM患者使用1.5倍的标准剂量，因为RM患者体内血药浓度降低，有发生INH抵抗的风险，导致治疗无效；而对于SM患者，则应使用一半的标准剂量以防止不良反应的发生。在中国大陆、中国台湾、南非以及许多其它国家和地区，INH是最常引发药物导致肝毒性的药物。我国是结核病高发的国家，大约有450万人患有结核病，因此十分有必要在INH用药之前对NAT2基因的多态性进行检测，帮助临床医生判断患者的乙酰化代谢类型，从而个体化制定用药剂量，以避免不良反应的发生。目前国内尚没有通过CFDA获批上市的NAT2基因多态性检测试剂盒，现有的研究方法主要为限制性片段长度多态性分析法、基因芯片法、ARMS-PCR法、测序法等。这些研究方法因其自身的局限性，不适用于临床样本的大规模应用。制性片段长度多态性分析法需要对PCR产物进行酶切、电泳，操作步骤繁琐，容易引起污染。基因芯片技术成本高、操作复杂，结果也会存在不同程度的假阳性。ARMS-PCR法检测的通量十分有限，而且需要PCR后处理，容易出现污染造成假阳性结果的发生。测序法检测周期较长，不适用于临床样本的快速分析。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种NAT2基因多态性荧光PCR熔解曲线检测试剂盒本专利技术的具体技术方案如下：一种NAT2基因多态性荧光PCR熔解曲线检测试剂盒，包括一第一探针、一第二探针、一第三探针、一第四探针、一正向引物和一反向引物，其中，第一探针包含如SEQIDNO01所示的序列，第二探针包含如SEQIDNO02所示的序列，第三探针包含如SEQIDNO03所示的序列，第四探针包含如SEQIDNO04所示的序列，正向引物包含如SEQIDNO05所示的序列，反向引物包含如SEQIDNO06所示的序列，第一探针、第二探针、第三探针和第四探针的5’端分别标记有不同的荧光基团，3’端均标记有相应的淬灭基团。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述荧光基团为CY5、HEX、ROX或FAM，所述淬灭基团为BHQ1或BHQ2。进一步优选的，所述第一探针的荧光基团为CY5，淬灭基团为BHQ2。进一步优选的，所述第二探针的荧光基团为HEX，淬灭基团为BHQ1。进一步优选的，所述第三探针的荧光基团为ROX，淬灭基团为BHQ2。进一步优选的，所述第四探针的荧光基团为FAM，淬灭基团为BHQ1。在本专利技术的一个优选实施方案中，其单管的反应体系包括：1×PCRbuffer、2UTaqDNA聚合酶、200μMdNTP、4.5mMMgCl2、正向引物4pmol、反向引物40pmol、第一探针2.5pmol、第二探针5pmol、第三探针7.5pmol和第四探针8.75pmol。进一步优选的，所述1×PCRbuffer中包括：Tris-HClpH8.567mM、(NH4)2SO416mM和0.1％(w/v)Tween。在本专利技术的一个优选实施方案中，其反应程序如下：(1)50℃2min，(2)95℃10min；(3)95℃15s→70℃～60℃1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种NAT2基因多态性荧光PCR熔解曲线检测试剂盒，其特征在于：，包括一第一探针、一第二探针、一第三探针、一第四探针、一正向引物和一反向引物，其中，第一探针包含如SEQ ID NO 01所示的序列，第二探针包含如SEQ ID NO 02所示的序列，第三探针包含如SEQ ID NO 03所示的序列，第四探针包含如SEQ ID NO 04所示的序列，正向引物包含如SEQ ID NO 05所示的序列，反向引物包含如SEQ ID NO 06所示的序列，第一探针、第二探针、第三探针和第四探针的5’端分别标记有不同的荧光基团，3’端均标记有相应的淬灭基团。
【技术特征摘要】
1.一种NAT2基因多态性荧光PCR熔解曲线检测试剂盒，其特征在于：，包括一第一探针、一第二探针、一第三探针、一第四探针、一正向引物和一反向引物，其中，第一探针包含如SEQIDNO01所示的序列，第二探针包含如SEQIDNO02所示的序列，第三探针包含如SEQIDNO03所示的序列，第四探针包含如SEQIDNO04所示的序列，正向引物包含如SEQIDNO05所示的序列，反向引物包含如SEQIDNO06所示的序列，第一探针、第二探针、第三探针和第四探针的5’端分别标记有不同的荧光基团，3’端均标记有相应的淬灭基团。2.如权利要求1所述的一种NAT2基因多态性荧光PCR熔解曲线检测试剂盒，其特征在于：所述荧光基团为CY5、HEX、ROX或FAM，所述淬灭基团为BHQ1或BHQ2。3.如权利要求2所述的一种NAT2基因多态性荧光PCR熔解曲线检测试剂盒，其特征在于：所述第一探针的荧光基团为CY5，淬灭基团为BHQ2。4.如权利要求2所述的一种NAT2基因多态性荧光PCR熔解曲线检测试剂盒，其特征在于：所述第二探针的荧光基团为HEX，淬灭基团为BHQ1。5.如权利要求2所述的一种NAT2基因多态性荧光PCR熔解曲线检测试剂盒，其特征在于：所述第三探针的荧光基团为ROX，淬灭基团为BHQ2。6.如权利要求2所述的一种NAT2基...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭晓彤，黄海荣，宋娜杰，
申请(专利权)人：厦门致善生物科技股份有限公司，首都医科大学附属北京胸科医院，
类型：发明
国别省市：福建;35
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