本发明专利技术提供一种与豌豆抗白粉病等位基因er1-6共分离的分子标记，所述分子标记位于豌豆遗传图谱第VI连锁群上，与等位基因er1-6的遗传距离为0cM。本发明专利技术根据含有抗性等位基因er1-6的抗病品种G0001778与感病品种坝豌6号的er1候选基因PsMLO1cDNA序列之间存在的单碱基差异(1121处，T→C)，在SNP突变位点两侧设计引物，利用高分辨率熔解曲线分析技术开发了与豌豆抗白粉病等位基因er1-6共分离的分子标记，该标记经抗病品种G0001778与感病品种坝豌6号杂交衍生的F2和F3群体检测，验证了该标记为与基因er1-6共分离的共显性功能标记。随后，利用该标记在豌豆抗白粉病资源鉴定中验证其有效性，此功能标记可用于豌豆抗白粉病的分子标记辅助选择育种，从而加速育种进程。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物病理学、遗传育种及分子生物学检测
，具体地说，涉及一种与豌豆抗白粉病等位基因er1-6共分离的分子标记及其应用。
技术介绍
由白粉菌(ErysiphepisiD.C.)引起的豌豆白粉病是世界性病害(Nisaretal.,2011；Fondevillaetal.,2012)。在我国南、北豌豆产区均有豌豆白粉病的发生。气候条件适宜的情况下，感病品种的侵染率高达100％，极大地影响豌豆产量和品质，造成严重的经济损失(彭化贤等，1991)。防治豌豆白粉病最为经济、有效且环境安全的方法是种植抗病品种。目前，国外已经鉴定了大量的抗白粉病豌豆资源，并在抗性资源中鉴定了3个独立遗传的抗白粉病基因(er1，er2，er3)(Harlandetal.,1948；Heringaetal.,1969)。迄今，除在豌豆资源JI2480中鉴定抗病基因er2和在豌豆野生种P.fulvum中鉴定er3外，大量抗性资源筛选和遗传分析方面的研究表明，许多不同地理起源的抗白粉病豌豆资源的抗性均由er1基因控制(Tiwarietal.,1997；Ghafooretal.,2012；Liuetal.,2003；Vaidetal.,1997)。目前生产中应用的抗白粉病豌豆资源的抗性均由er1控制。er1基因具有广谱、持久抗性，已在欧洲、北美洲及澳大利亚的豌豆育种中广泛应用(Fondevillaetal.,2007)。抗病基因er1和er2分别被定位在豌豆遗传图谱的第6连锁群(LGVI)(Timmermanetal.,1994)和第3连锁群(LGⅢ)(Katochetal.,2010)。最近研究发现，豌豆抗白粉病基因er1是由感病基因PsMLO功能丧失而产生的(Humphryetal.，2011；Pavanetal.,2011)。在自然和诱变条件下，豌豆PsMLO同源序列发生碱基缺失、插入、替换等导致不同的er1等位基因产生，目前已经鉴定了5个er1等位基因即er1-1、er1-2、er1-3、er1-4和er1-5(Humphryetal.,2011；Pavanetal.,2011)。除了er1-2是由大片段的插入和缺失产生的，其他4个等位基因都是由单碱基的缺失、插入、替换产生的。随着分子标记技术在分子辅助育种中的广泛应用，Pavan等(2013)基于不同的分子标记技术，开发了已鉴定的er1的5个等位基因的功能标记，但这些功能标记的有效性尚未被验证。高分辨率熔解曲线(HighResolutionMelting,HRM)分析技术是近年来兴起的一种检测基因单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism,SNP)的新技术(Kristensenetal.,2008)。最近研究人员在中国豌豆地方品种中筛选出了一些白粉病免疫资源(王仲怡等，2012)。通过er1的候选基因PsMLO序列分析在中国豌豆地方品种中鉴定了一个新等位基因er1-6，该基因在PsMLO1cDNA序列开放阅读框第1121个碱基处发生突变，T替换为C，这一碱基突变导致氨基酸序列由亮氨酸变成脯氨酸，从而引起蛋白功能的变化。为加速分子辅助选择育种，开发与等位基因er1-6共分离的功能性分子标记成为亟待解决的技术问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种与豌豆抗白粉病等位基因er1-6共分离的分子标记及其应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术的一种与豌豆抗白粉病等位基因er1-6共分离的分子标记，所述分子标记位于豌豆遗传图谱第VI连锁群上，与等位基因er1-6的遗传距离为0cM，用于PCR扩增所述分子标记的特异性引物对如下，扩增产物大小为158bp；上游引物F:5’-CTGGAGATCACCTTTTCTGGTT-3’和下游引物R：5’-CATGTACAAACACACATACACACG-3’。其中，PCR扩增使用的退火温度为59℃。本专利技术还提供所述的分子标记在鉴定豌豆抗白粉病种质资源中的应用。具体地，所述应用包括以下步骤：1)提取待测豌豆的基因组DNA；2)以待测豌豆的基因组DNA为模板，利用所述的用于PCR扩增所述分子标记的特异性引物对，进行PCR扩增反应；3)利用HRM分析技术检测PCR扩增产物。其中，PCR扩增反应使用的扩增体系以10μl计为：豌豆基因组DNA25ng，10×PCR反应缓冲液(25mMMgCl2)1μl，5mM引物F0.25μl，5mM引物R0.25μl，10×HRMFastMasterMix(HRMFastPCRKit,KapaBiosystems,USA)5μl，ddH2O补足至10μl。PCR扩增反应的条件为：95℃5分钟；94℃10秒，59℃30秒，72℃10秒，50个循环；72℃10分钟。本专利技术利用HRM分析技术检测PCR扩增产物，所有含有等位基因er1-6的豌豆资源均出现一条相同的熔解曲线，而其他抗病或感病豌豆资源均形成另外一条与er1-6明显不同的熔解曲线。本专利技术还提供用于PCR检测抗白粉病豌豆资源的试剂盒，所述试剂盒中含有所述的用于PCR扩增所述分子标记的特异性引物对。优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液、HRMFastMasterMix、标准阳性模板等中的至少一种。本专利技术进一步提供所述的分子标记在植物分子标记辅助育种中的应用。本专利技术还提供含有上述引物对的用于检测抗白粉病豌豆的试剂盒。优选所述试剂盒还包括上述MasterMix(Tiangen)和HRMFastMasterMix(HRMFastPCRKit,KapaBiosystems,USA)和标准阳性模板中的一种或多种。具体地，本专利技术的与豌豆抗白粉病er1等位基因er1-6共分离的分子标记是通过以下方法获得的：利用抗病品种G0001778与感病品种坝豌6号的PsMLO1cDNA序列的SNP差异(T→C)，在PsMLO1cDNA序列SNP突变位点两侧分别设计引物，开发与豌豆抗白粉病等位基因er1-6共分离的分子标记，随后，将该标记用于鉴定抗病亲本G0001778与感病亲本坝豌6号杂交衍生的F2群体的各单株的基因型，通过HRM技术分析，该标记在F2群体中出现三种明显不同的熔解曲线，分别对应于纯合抗病基因型、纯合感病基因型和杂合基因型三种类型。这三种基因型与F3群体的表现型一一对应。证明该标记为与抗病基因er1-6共分离的分子标记。随后，将所述分子标记用于鉴定豌豆抗白粉病资源。结果表明，所述分子标记能够有效区分出含有抗白粉病等位基因er1-6的豌豆资源。本专利技术为豌豆抗白粉病分子辅助选择育种提供分子标记，从而加速豌豆抗白粉病育种工作进程。具体实施方案：(1)er1-6的功能分子标记开发根据含有er1-6的抗病品种G0001778和感病品种坝豌6号的候选基因PsMLO1序列比对结果，er1-6与PsMLO1cDNA序列之间存在单碱基差异(1121处，T→C)，用PrimerPremier5.0软件本文档来自技高网...
【技术保护点】
与豌豆抗白粉病等位基因er1‑6共分离的分子标记，其特征在于，所述分子标记位于豌豆遗传图谱第VI连锁群上，与等位基因er1‑6的遗传距离为0cM，用于PCR扩增所述分子标记的特异性引物对如下，扩增产物大小为158bp；上游引物F:5’‑CTGGAGATCACCTTTTCTGGTT‑3’和下游引物R：5’‑CATGTACAAACACACATACACACG‑3’。
【技术特征摘要】
1.与豌豆抗白粉病等位基因er1-6共分离的分子标记，其特征在
于，所述分子标记位于豌豆遗传图谱第VI连锁群上，与等位基因er1-6
的遗传距离为0cM，用于PCR扩增所述分子标记的特异性引物对如
下，扩增产物大小为158bp；
上游引物F:5’-CTGGAGATCACCTTTTCTGGTT-3’和
下游引物R：5’-CATGTACAAACACACATACACACG-3’。
2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，PCR扩增使用
的退火温度为59℃。
3.权利要求1或2所述的分子标记在鉴定豌豆抗白粉病种质资源
中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下
步骤：
1)提取待测豌豆的基因组DNA；
2)以待测豌豆的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述的用于
PCR扩增所述分子标记的特异性引物对，进行PCR扩增反应；
3)利用HRM分析技术检测PCR扩增产物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤2)中PCR扩
增反应使用的扩增体系以10μl计为：豌豆基因组DNA25ng，含25mM
MgCl2的10×PC...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙素丽，朱振东，钟超，孙菲菲，段灿星，武小菲，王晓鸣，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。