本发明专利技术公开了一种利用骨桥蛋白基因多态性早期评估前列腺癌发病风险的方法及诊断试剂盒。本发明专利技术属于生物技术发明专利技术，主要特征如下：通过对骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)基因中包含SNP(10)、SNP(11)、SNP(13)、SNP(15)、SNP(22)rs2853749、SNP(23)rs2853750构成的单体型和包含SNP(35)rs6532039、SNP(49)rs4754和SNP(59)rs1126616构成的单体型进行基因定型，可评估前列腺癌发病风险，用于早期诊断和鉴别诊断。本发明专利技术适用于对体检人群、具有癌症家族史及有检查意愿的个体进行前列腺癌发病风险评估和早期诊断，也可用于前列腺癌与前列腺增生的鉴别诊断。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术专利技术，利用骨桥蛋白(Osteopontin，0ΡΝ)基因多态性早期评估前列腺癌发病风险的方法及诊断试剂盒。
技术介绍
前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤，占男性癌症死因的第二位，约占所有男性癌症患者的40%。近年随着人口老龄化及生活条件的改善，发病率有明显增加的趋势。前列腺癌通常生长缓慢，患者常常在发病数年之后才出现明显的症状或体征，因此及时发现并早期治疗是前列腺癌诊治的关键，然而前列腺癌的发病原因目前尚不清楚。人类基因组计划的完成使我们对癌症分子机制的认识步入了新的阶段。基因多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)普遍存在于机体DNA序列中，是构成疾病敏感性的基因基础，通过病例对照研究不仅对于发现癌症相关基因及阐明其作用机制起着重要作用，而且对于癌症易感性早期风险诊断，个体化医疗具有重要意义。骨桥蛋白(Osteopontin, 0ΡΝ)是一种磷酸化酸性糖蛋白，具有多功能细胞因子作用，同时也具有粘着蛋白的功能。OPN在多种细胞中有表达，包括巨噬细胞，上皮细胞，平滑肌细胞和内皮细胞等，并存在于机体的各种体液中，参与细胞迁移、细胞介导的免疫、细胞存活、组织损伤等多种生物过程。OPN作为一种炎症调节因子，能延长自动攻击免疫细胞的寿命，参与细胞介导的启动免疫，刺激Thl细胞因子表达而抑制Th2细胞因子的表达，直接调节巨噬细胞分泌这些细胞因子，并通过巨噬细胞发挥肿瘤免疫监视作用。OPN基因和蛋白在许多肿瘤，如乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌、卵巢癌和胃癌中都增加表达，并影响肿瘤形成、生长和转移。专利技术内容本专利技术要解决的技术问题是提供一种通过分析人类OPN基因多态性早期评估前列腺癌发病风险的方法和为开发前列腺癌诊断试剂盒提供靶点。本专利技术对26例前列腺癌患者和38例健康人采集末梢静脉血，提取基因组DNA，通过长片段精确PCR扩增OPN基因及其上下游DNA片段，纯化PCR产物。对人类OPN基因的获得，也可通过采集人静脉血、上皮细胞(如口腔上皮细胞)、毛发、手术中获得的组织等。本专利技术中PrimerPremier 5. O软件用于引物设计,测序引物的覆盖区域尽可能设计成首尾重叠，可对OPN基因进行全序列测序(如图I)。测序PCR反应使用ABI BigDyeTerminatorCycle sequencing Ready Reaction Kit,每个反应包括 50ng 的 LR-PCR 产物。反应条件为95°C 15s，55°C 15s，60°C 4min共25循环。反应产物被提纯后在ABI3700automated DNA sequencer中电泳。序列通过SeqScapeV2. I软件与已知序列比对，混合峰中第二个峰大于主峰的45%则被确认为SNPs。对SNP位点的基因型定型方法还包括限制性片段长多型、5’核酸内切酶分析(TaqMan探针技术)、高分辨溶解曲线变异分析技术、PCR-SSP法、变性梯度凝胶电泳法、PCR-ASO法单链构象多态性技术和基因芯片技术等。本专利技术中使用的统计方法用卡方检验和Fisher精确检验计算Hardy-Weinberg平衡，比较前列腺癌患者和健康个体间的等位基因型和单体型分布。Haploview软件包用来评估连锁不平衡(linkage disequilibrium, LD),识别 haplotype tagging SNPs (htSNPs)。检验用SPSS10. O统计软件包进行统计分析，P < O. 05为有显著性统计学差异。本专利技术中确定了 69个SNPs位点的基因型，其中次等位基因率大于1%的SNP位点有27个，连锁不平衡分析产生3个连 锁块和13个htSNPs(如图2)，相关性分析发现由 SNP(10)、SNP(Il)、SNP(13)、SNP(15)、SNP(22)、SNP(23)构成的单体型组合和由SNP (35)、SNP (49)、SNP (59)构成的单体型组合与前列腺癌发病风险相关。其中，SNP10-11-13-15-22-23构成的单体型为T-G-C-C-T-G的个体的前列腺癌发病风险将明显增加(P = 3. 64X IO-6)，而为G-T-C-C-T-G的个体的前列腺癌发病风险将显著降低(P =O. 0185)。本专利技术中又通过对26例前列腺癌患者和29例前列腺增生患者进一步OPN基因多态性位点分析发现SNP(35)、SNP(49)、SNP(59)构成的单体型组合也可用于鉴别诊断前列腺癌与前列腺增生，当单体型为A-C-T时，前列腺癌的几率明显增加(P = O. 002)，而单体型为G-T-C时前列腺增生的几率增加(P = O. 002)。本专利技术用于评估前列腺癌发病风险的OPN基因包括9个多态性变异位点。(注多态性变异位点定位参照人类OPN基因序列，D14813，序列见“核苷酸或氨基酸序列表”)I)SNP (10)，定位在OPN基因启动子领域第2122位置，多态性变异类型为T/G。2) SNP (11)，定位在OPN基因启动子领域第2123位置，多态性变异类型为G/T。3) SNP (13)，定位在OPN基因5’UTR领域第2317位置，多态性变异类型为C/T。4) SNP (15)，定位在OPN基因5’UTR领域第2337位置，多态性变异类型为C/T。5) SNP (22)，定位在OPN基因内含子I领域第2337位置，编号rs2853749，多态性变异类型为C/T。6) SNP (23)，定位在OPN基因内含子I领域第2337位置，编号rs2853750，多态性变异类型为A/G。7) SNP (35)，定位在OPN基因内含子3领域第位置，编号rs6532039，多态性变异类型为A/G。8) SNP (49)，定位在OPN基因外显子6领域第位置，编号rs4754，多态性变异 类型为C/T。9) SNP (59)，定位在OPN基因外显子7领域第位置，编号rsl 126616，多态性变异类型为T/C。其中A代表腺嘌呤，G代表鸟嘌呤，C代表胞嘧啶，T代表胸腺嘧啶。筛选出的9个SNP位点可单独或两个及两个以上位点组成等位基因单体型，也可与OPN基因中或基因外附近的其他SNP位点组成单体型用于评估前列腺癌发病风险和作为前列腺癌诊断试剂盒的靶点，也可用于鉴别诊断前列腺癌与前列腺增生。上述中的SNP(IO)和 SNP(Il)与 SNPrs3841116 (-/G/T)相关，当 SNPrs3841116 为 碱基缺失基因型时，SNP (10)为“T”，SNP(Il)为“G”;当SNPrs3841116为“G/T”基因型时，SNP(IO)和(11)的等位基因均为“G/T”。SNP (35)、SNP (49)、SNP (59)也可以和OPN基因中或OPN基因外围中的其他SNP位点共同组成单体型评估前列腺癌发病风险，也可用于鉴别诊断前列腺癌与前列腺增生。本专利技术适用于对体检人群、具有癌症家族史及有检查意愿的正常个体进行前列腺癌发病风险评估和早期诊断。附图说明图I、长PCR扩增OPN基因及全序列基因测序。图2、在前列腺癌患者和健康人之间OPN基因的连锁不平衡分析。具体实施方式 OPN基因中SNP10-11-13-15-2本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种通过检测基因多态性变异位点早期评估前列腺癌风险的方法及诊断试剂盒，适用于对体检人群、具有癌症家族史及有检查意愿的个体进行前列腺癌发病风险评估和早期诊断。其特征在于，检测基因为人类骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)基因。人类OPN基因定位在 4q21-q25,也称 SECRETED PH0SPH0PR0TEIN I 或 SPPI, MIM ID 为 166490。2.如权利要求I中所述的通过检测人类OPN基因多态性变异位点早期评估前列腺癌风险的方法及诊断试剂盒，其特征在于，包括OPN基因的以下9个多态性变异位点(注多态性变异位点定位参照人类OPN基因序列，GenBank D14813，序列见“核苷酸或氨基酸序列表”) 1)SNP (10)，定位在OPN基因启动子领域第2122位置，多态性变异类型为T/G。2)SNP (11)，定位在OPN基因启动子领域第2123位置，多态性变异类型为G/T。 3)SNP (13)，定位在OPN基因5’ UTR领域第2317位置，多态性变异类型为C/T。 4)SNP (15)，定位在OPN基因5’ UTR领域第2337位置，多态性变异类型为C/T。5)SNP (22)，定位在OPN基因内含子I领域第2337位置，编号rs2853749，多态性变异类型为C/To 6)SNP (23)，定位在OPN基因内含子I领域第2337位置，编号rs2853750，多态性变异类型为A/G。7)SNP (35)，定位在OPN基因内含子3领域第位置，编号rs6532039，多态性变异类型为A/G。8)SNP (49)，定位在OPN基因外显子6领域第位置，编号rs4754，多态性变异类型为C/T。9)SNP (59)，定位在OPN基因外显子7领域第位置，编号rsl 126616，多态性变异类型为T/C。其中A代表腺嘌呤，G代表鸟嘌呤，C代表胞嘧啶，T代表胸腺嘧啶。3.如权利要求I和2中所述的9个SNP位点可单独或两个及两个以上位点组成等位基因单体型，也可与OPN基因中或基因外附近的其他SNP位点组成单体型用于评估前列腺癌发病风险和作为前列腺癌诊断试剂盒的靶点，也可用于鉴别诊断前列腺癌与前列腺增生。4.如权利要求I至4中所述的SNP(IO)和SNP(Il)，其特征在于，与定位在OPN基因2113 位置的 SNPrs3841116 (-/G/T)相关，当 SNPrs3841116 为碱基缺失时，SNP(IO)为“T”，SNP(Il)为 “G”；当 S...
【专利技术属性】
技术研发人员：高兵，芦秀丽，邓智先，刘健，王有亮，刘泽辉，朱志强，
申请(专利权)人：沈阳医学院，
类型：发明
国别省市：
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