本发明专利技术公开了一种人乳腺癌基因分型实时荧光定量PCR检测方法，以人乳腺癌基因ERα（SEQID9）、PR（SEQID10）、HER-2（SEQID11）作为扩增的靶基因序列，以18SrRNA（SEQID12）作为内参基因，分别设计与所述ERα、PR、HER-2、18SrRNA基因相对应的特异性引物，采用实时荧光定量PCR方法检测待测样品和对照样品的CT值，计算靶基因表达量；利用ΔΔCT法对靶基因表达量进行分析，所述靶基因表达量=2-ΔΔCT，ΔΔCT=(CT,target-CT,18S)(detected)-(CT,target-CT,18S)(control)；当所述靶基因表达量≤1时，所述ERα、PR、HER-2基因为阴性分型；当所述靶基因表达量＞1时，所述ERα、PR、HER-2基因为阳性分型。本发明专利技术操作简便，检测灵敏度高，检测时间短，特异性、重复性好，结果准确可靠，可定性、定量检测，可用于一般人群或乳腺癌患者的基因分型鉴定，为乳腺癌患者提供了个性化用药的重要理论指标，对乳腺癌患者预后具有重要意义，具有很强的推广性和实用性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生理生化检测领域，具体地涉及一种人乳腺癌基因分型实时荧光定量PCR检测方法。
技术介绍
乳腺癌是危害妇女健康的主要恶性肿瘤之一，全世界每年约有一百多万妇女患有乳腺癌，并且大约有50万名妇女死于该疾病。近年来，在中国乳腺癌的发病率呈明显上升趋势，尤其是在沿海经济发达地区，乳腺癌发病率已居于女性恶性肿瘤的首位。乳腺癌预后与癌细胞的侵袭和早期转移密切相关而转移是导致乳腺癌患者死亡的主要原因。如何早期将具有潜在转移危险的患者筛选出来，给予有针对性的治疗是提高乳腺癌生存率的关键所在。ER、PR和HER-2受体的状态既与患者的预后相关，又能预测治疗的反应性。因此，在临床上，被作为一种公认的基因分型及预后因子而纳入治疗指南，其检测结果作为制定患者治疗方案及预后判断的最重要指标。雌激素受体(ER)属于能和小分子疏水配体结合的核受体超家族成员，介导雌激素的多向效应。与雌激素结合时，热休克蛋白分离，丝氨酸与苏氨酸磷酸化，然后受体与另一 ER单体发生二聚化作用，激活E-ER复合物，并促进受体二聚物与位于靶基因启动子区域的雌激素反应原件(ERE)结合，诱发或抑制基本转录机制的装配，刺激靶基因转录，从而调节雌激素促进细胞增生，分化和维持正常的生理功能。ER在人体内广泛分布，除生殖系统夕卜，其它组织如骨骼、心脏、血管、神经、肝脏、皮肤等均有发现。ER包括ERa、ERi3两种亚型。ERa的表达状态与乳腺癌患者的预后明显相关，并指导内分泌治疗，是选择治疗方案的重要标志物(Speirs V, Kerin MJ. Prognostic significance of oestrogen receptorbeta in breast cancer. Br J Surg, 2000,87 (9) :1248-9)。Ricketts 等发现在正常人乳腺组织中ERa表达水平较低，平均为4 fmol/mg，肿瘤发生后，根据ERa表达水平的高低可以将乳腺癌病人分为ERa阳性和ERa阴性两类，早期的乳腺癌病人大约有60%为ERa阳性，癌组织中ERa表达升高，可以达到100 fmol/mg，其中2/3的病人对内分泌治疗有效。超过1/3的早期病人为ERa阴性，癌组织中几乎检测不到ERa的表达。而且随着肿瘤的发展，部分ERa阳性病人可能转变为ERa阴性，同时内分泌治疗也失去疗效(Ricketts D, Turnbull L, Ryall G, et al. Estrogen and progesterone receptorsin the normal female breast. Cancer Res, 1991, 51 (7): 1817 1822)。英国诺丁汉城市医院国家卫生联合协会Rakha等对1944例对可手术的原发侵袭性乳腺癌的长期随访资料显示ER阳性乳腺癌多见于年长、绝经后妇女，肿瘤分化程度中等，对三苯氧胺(TAM)和芳香化酶抑制剂等内分泌治疗有效；ER阴性多见于年轻、绝经前妇女，肿瘤分化程度低，对内分泌治疗基本无效(Rakha EA, El-Sayed ME, Green AR, et al. Biologic andclinical characteristics of breast cancer with single hormone receptor positivephenotype. JClin Oncol, 2007, 25(30) : 4772-8)。ER 阳性如有复发时常倾向于皮肤、软组织或骨转移；ER阴性则倾向于内脏转移，预后效果较ER阳性差。孕激素受体(PR)是核受体超家族中的一员，与其它的核受体一样，可以配体或非配体方式，通过与共活化分子和共抑制分子相互作用调控靶基因的转录，影响其转录活性，进而影响乳腺的正常发育，导致肿瘤的发生。PR基因主要编码两个异构体PR-A和PR-B。PR-B是一个转录活化因子，PR的主要活性形式，而PR-A则表现为PR-B转录活性的抑制因子。二者在多数正常的孕激素靶向细胞中的共表达水平是相似的，它们之间的平衡调控着多种其它基因。当PR-A和PR-B的比例明显改变时，就会造成孕激素信息传递的改变，这种异常的信号与乳腺癌的发生发展有关，而且PR-A/PR-B的比值越高，患者的预后越差(Rebecca L, Arnett-Mansfield, Anna deFazio, et al. Relative Expression ofProgesterone Receptors A and B in Endometrioid Cancers of the Endometrium..CANCER RESEARCH，2001，61 :4576 - 4582，)。Shyamala 等发现在 PR-A 过量表达的转基因小鼠中，乳腺组织的分支增多，导管增生现象明显，而且细胞与细胞之间的粘附能力减弱(Shyamala G,Yang X, Silberstein G, et al. Transgenic mice carrying an imbalancein the native ratio of A to B forms of progesterone receptor exhibit development 的转基因小鼠中，乳腺组织的血管发育不全，腺管、腺泡发育异常(Shyamala G, Yang X，Cardif RD, et al. Impact of progesterone receptor on cell-fate decisions duringmammary gland development. PNAS, 2000, 97 (7) : 3044-9)。Graham 等通过免疫印迹分析了 202例PR阳性的乳腺癌标本发现，59%的肿瘤组织中PR-A的表达水平高于PR-B的表达水平，其中25%的肿瘤PR-A的表达水平高于PR-B 4倍以上。另一项对53例PR阳性乳腺癌的研究表明，PR-B的过表达与Her-2/neu的低表达相关，提示预后良好。而PR-A的过表达与更差的分化表型和更高的肿瘤分级有关。PR-A过表达的乳腺癌细胞系，表现出明显的形态学改变和粘附特性的丧失，提示PR-A的过表达对乳腺是不利因素。最近有学者应用PR敲除的小鼠模型证明，PR在二甲基苄基蒽诱导的乳腺癌发生过程中起作用。用抗孕激素药物和PR反意寡核苷酸则可明显抑制肿瘤的生长。人表皮生长因子受体2 (HER-2)属于受体酪氨酸激酶(RTK)类癌基因，是表皮生长因子受体家族的成员之一。Her基因定位于染色体17q2f 22区，转录4. 8 kb的mRNA，编码185 ku具有酪氨酸激酶活性的单链跨膜糖蛋白(Gupta D, Middleton L P, Whitaker M J,Abrams J. Comparison of fluorescence and chromogenic in situ hybridization fordetection of HER-2/neu oncogene in breast cancer. Am J Clin Pathol, 2003, 119:381- 387)。H本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种人乳腺癌基因分型实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述方法是以人乳腺癌相关基因 ERa (SEQ ID 9)、PR (SEQ ID 10)、HER-2 (SEQ ID 11)作为扩增的靶基因序列，以18S rRNA (SEQ ID 12)作为内参基因，分别设计与所述ER a、PR、HER-2、18S rRNA基因相对应的特异性引物，采用实时荧光定量PCR方法检测待测样品和对照样品的Ct值，计算靶基因表达量；利用△ ACT法对靶基因表达量进行分析，所述靶基因表达量=2 A ACT，A A Ct= ( CT； target- CT；18S) (detected)- ( CT，target_ CT； 18s) (control);当所述革巴基因表达量彡I时，所述ER a、PR、HER-2基因为阴性分型；当所述靶基因表达量〉I时，所述ER a、PR、HER-2基因为阳性分型。2.如权利要求I所述方法，其特征在于，所述方法是以pMD 19-T作为质粒载体，分别以基因片段 ERa (SEQ ID 13),PR (SEQ ID 14)、HER_2 (SEQ ID 15)、18S rRNA (SEQ I...
【专利技术属性】
技术研发人员：彭金彪，陈晶，陆敬舟，程朝平，
申请(专利权)人：上海易瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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