本发明专利技术涉及生物技术领域，公开了用于检测BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药突变位点的扩增引物，其上游引物核苷酸序列如SEQ?ID?No.1或如SEQ?ID?No.2所示，下游引物核苷酸如SEQID?No.3所示。本发明专利技术还公开一种检测BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药突变位点的方法及试剂盒。本发明专利技术经一步法PCR扩增CML患者的BCR/ABL融合基因，再用特异性测序引物进行测序，在一个反应体系中可以检测二十多种常见的BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药突变，降低了实验的成本，极大的提高了基因测序结果的准确性和灵敏度，有着大规模推广应用的前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，特别涉及一种检测BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药突变位点的方法及试剂盒。
技术介绍
慢性粒细胞白血病(Chronic Myelognous Leukemia,CML)是一种发生于造血干细 胞的血液系统恶性克隆增生性疾病，在我国的发病率为36/10万人，其中90%以上病例均具有BCR/ABL融合基因。BCR/ABL融合基因是由人体细胞第9号染色体上的ABL原癌基因与第22号染色体上的BCR基因相互易位形成的融合基因，可引起蛋白激酶持续性激活，使白细胞过分増殖而出现慢性粒细胞白血病。人ABL基因位于9号染色体长臂，有lb、la和2 11共12个外显子。转录始自Ib或la，形成的两种mRNA长度分别为7kb和6kb，形成两种转录本，每种转录本由11个外显子组成，合成的两种蛋白质分子量均约为145kD，前者定位于细胞膜，而后者主要在细胞核内。ABL蛋白參与细胞周期调节。人BCR基因位于22号染色体长臂，有23个外显子。BCR蛋白的I 63个氨基酸參与BCR蛋白多聚体的形成。BCR/ABL融合基因见于95%以上CML患者，也见于20% 25%成人ALL和2% 4%儿童ALL患者。约6%成人急性髓细胞性白血病(acute myeloblastic leukemia, AML)、I %儿童AML和10%急性混合细胞型白血病(acute mixed lineage leukemia, AMLL)患者中也可检测到BCR/ABL融合基因。不同的BCR/ABL融合基因类型与疾病表型相关。BCR/ABL融合基因中，主要由ABL段携带细胞恶变的主要信息，而BCR段的断裂位点主要影响疾病表型。BCR基因常见的断裂点有三个，如图I所示(I)M-BCR区，位于外显子bl b5之间5. 8kb的区域，转录成b2a2或b3a2型mRNA，编码210kD的BCR/ABL融合蛋白(p210)，见于90 %以上的CML和33 %的Ph+成人ALL患者。(2)m-BCR区，位于外显子e2'和e2之间的54. 4kb的区域，转录成ela2型mRNA，编码190kD的融合蛋白(pl90)，见于2/3的Ph+成人B_ALL、3%的非典型CML和慢性粒细胞-单核细胞白血病(chronic myelomonocytic leukemia, CMML)患者。(3) μ -BCR区，位于外显子19下游，转录成el9a2型mRNA，编码p230kD的融合蛋白，主要见于Ph+的慢性中性粒细胞白血病(chromic neutrophilic leukemia, CNL)。慢性粒细胞白血病的BCR基因断裂点常位于M-BCR，主要是b2a2和b3a2，蛋白分子量为210kb。因断裂点不一，BCR/ABL融合基因及其mRNA和蛋白产物呈多样性。目前世界上已报道的常见27个位点33种常见BCR/ABL融合基因耐药突变如M244V、L248V、G250E、Q252H/R、Y253F/H、E255K/V、D276G、T277A、E279K、F311L、T315I、F317L、L324Q、M343T、A344V、A350V、M351T、E355G、F359C/V,V379I、F382L、L387M/F、M388L、H396R、A397P、E450G/K、E459K，具有这些突变的慢性粒细胞白血病患者预后差，生存率低，其中，激酶区P-Loop片段中L248V，G250E, Q252H/R，Y253F/H，E255K/V突变预后较其它突变预后差，T315I预后最差。ABL基因N端具有酪氨酸激酶活性。ABL激酶区位于AA第235 509(M14752 :1067bp 1891bp)区，由P环结构(P-Ioop),激酶催化区(kinase domain)及A环结构(A-Ioop)三部分组成。因此，当染色体发生t (9，22)易位，即BCR与ABL形成融合基因时，能够导致患者骨髓细胞内多种蛋白酪氨酸激酶水平紊乱，进而导致疾病的发生。靶向治疗药物格列卫(imatinib)为BCR/ABL融合基因阳性CML患者带来了福音，但是临床治疗后发现，约50%的CML患者由于其BCR/ABL融合基因ABL激酶区存在多种类 型突变而造成对格列卫耐药，甚至部分CML患者还存在对格列卫的原发耐药。2010年美国国立综合癌症网络(NCCN)指出，BCR/ABL融合基因ABL激酶区突变对CML患者治疗效果及病情进展具有重要的提示作用。检测BCR/ABL融合基因的分子生物学方法前期主要进行定性检测，目前荧光定量PCR(RQ-PCR)方法被更多地应用，RQ-PCR进ー步提供了定量监测肿瘤细胞水平的准确方法，BCR/ABL融合基因的水平与临床疗效有很好的相关性，并能预先对临床病情变化提出警示，对于肿瘤微小残留病的监测和及时调整治疗方案都有重要意义。由于ABL激酶区突变存在跨越片段长，突变种类多达二十几种且还存在未知突变类型，目前对于检测BCR/ABL基因耐药突变，只有针对某一个已知突变位点用传统的RQ-PCR方法进行检测，远远无法满足临床医生对患者的全面认识而做出正确的诊断并实施个体化的治疗方案。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能检测多种BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药突变位点的方法。为解决上述技术问题，本专利技术提供了ー组用于检测BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药突变位点的扩增引物，上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. I或如SEQ ID No. 2所示，下游引物核苷酸如SEQ ID No. 3所示。其中BCR/ABL融合基因P190形的扩增引物为P190F、ABLRP190F (BCR1 号外显子):如 SEQ ID No. I 所示5' -TCCCTCGCAGAACTCGCAAC-3' (NM_004327 :1703 1722)ABLR(AB Lll 号外显子):如 SEQ ID No. 3 所示5' -CGAGGGAGCAATGGAGACACG-3' (M14752 :2065 2085)BCR/ABL扩增引物P210型的扩增引物P210F、ABLRP210F (BCR11 号外显子):如 SEQ ID No. 2 所示5' -GCTGTCGGAGCAGGAGTCAC-3' (NM_004327 :3047 3066)ABLR (ABL11 号外显子):如 SEQ ID No. 3 所示5' -CGAGGGAGCAATGGAGACACG-3' (M14752 :2065 2085)作为优选，本专利技术所述用于检测BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药突变位点的两组扩增引物同时使用，上游引物核苷酸序列如SEQID No. I和如SEQ ID No. 2所示，下游引物核苷酸如SEQ ID No. 3所示。本专利技术主要针对常见的M-bcr和m_bcr融合基因耐药突变检测,其中Μ-bcr断裂位点主要集中在BCR第12 16号外显子，分别命名为bl b5，表达P210融合蛋白；m_bcr断裂位点主要集中在BCR第I号内含子内。目前，国际上大多数M-bcr引物都是设计在第13号外显子或14号外显子上，虽然能扩增大多数的b2，b3型，但是并不能将所有的P210都本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.用于检测BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药突变位点的扩增引物，上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. I或如SEQ ID No. 2所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。2.用于检测BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药突变位点的扩增引物，上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. I和如SEQ ID No. 2所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。3.用于检测BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药突变位点的测序引物，上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示,下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示。4.用于检测BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药突变位点的测序引物，上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示,下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 7所示。5.用于检测BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药突变位点的测序引物组，第一测序引物组，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示； 第二测序引物组，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 7 所示。6.一种检测BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药突变位点的方法 步骤I :取人cDNA待测样品...
【专利技术属性】
技术研发人员：沈宏杰，何军，邱桥成，岑建农，
申请(专利权)人：苏州大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：
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