本发明专利技术涉及突变Δ５去饱和酶，其具有使二高－γ亚麻酸［ＤＧＬＡ；２０：３ω－６］转化为花生四烯酸［ＡＲＡ；２０：４ω－６］和／或使二十碳四烯酸［ＥＴＡ；２０：４ω－３］转化为二十碳五烯酸［ＥＰＡ；２０：５ω－３］的能力并且在细胞色素ｂ５－样结构域的ＨＰＧＧ基序中有至少一个突变。公开了分离的核酸片段和包含编码Δ５去饱和酶的此类片段的重组构建体，以及用这些突变Δ５去饱和酶在含油酵母中制备长链多不饱和脂肪酸［“ＰＵＦＡｓ”］的方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术属于生物
更具体地讲，本专利技术与编码突变Δ5脂肪酸去饱和酶 (其中在细胞色素b5-样结构域的HPGG基序发生至少一个突变)的核酸片段的构建和这些去饱和酶在长链多不饱和脂肪酸的制备中的使用有关。
技术介绍
包括植物、藻类、真菌、原生藻菌(stramenopiIes)和酵母在内的多种不同宿主正作为商业化多不饱和脂肪酸生产的手段被研究。基因工程已经证明，一些宿主 (即使是亚油酸和α -亚麻酸脂肪酸生产天然地受限的那些)的天然能力能够被基本上改造以实现多种长链ω-3/ω-6 PUFA的高水平生产。花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸 的生产可能都需要△ 5去饱和酶的表达，无论这是天然能力还是重组技术的结果。迄今鉴定的大多数Δ5去饱和酶具有将二高-Y-亚麻酸转化为ARA的主要活性，和将二十碳四烯酸转化为EPA的次要活性。在公开文献和专利文献中均已公开了多种Δ5去饱和酶。基于去饱和酶的进化，P. Sperling等人(Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids, 68 :73-95(2003)对 Δ 5 去饱禾口醇的一般特性作了很好的描述。连同Δ6、Δ8和Δ4去饱和酶一起，已知Δ5去饱和酶是长链 PUFA “前端”去饱和酶(其中去饱和发生在业已存在的双键和脂肪酸酰基的羧基末端之间， 与甲基定向的去饱和相反)。这些去饱和酶的特征在于三个组氨酸框，并且是细胞色素 b5融合超家族的成员，因为它们在N末端具有融合的细胞色素b5结构域，该的细胞色素b5 结构域，该结构域起到电子供体的作用。所述细胞色素b5结构域还包含保守的血红素结合基序(即，组氨酸-脯氨酸-甘氨酸-甘氨酸序列或者叫“HPGG”序列)， 尽管其余的细胞色素b5结构域序列有差异。这些基序序列是美国专利5，972，664的主题。一些研究已表明HPGG基序与酶活性有关。Sayanova，0.等人(Plant Physiol.， 121 :641(1999))进行了定点诱变以在琉璃苣的Δ 6去饱和酶中用丙氨酸残基取代HPGG 基序的组氨酸残基。在拟南芥中表达了突变酶；然而却未能检测到酶活性，表明去饱和酶的细胞色素b5结构域对于功能是重要的。在大鼠Δ6去饱和酶中进行了类似的研究，其中在HPGG基序中进行了丙氨酸对组氨酸的取代。突变蛋白质同样不具有活性(Guillou， H.，等人，J. Lipid Res. ,45 :32-40 (2004)) 最近，Hongsthong，Α·等人(Appl. Microbiol. Biotechnol. ,72 :1192-1201(2006))报告了在螺旋藻(Spirulina)的 Δ6 去饱和酶中，用丙氨酸残基对HPGG基序的组氨酸残基的取代。与之前的报道一样，突变使得突变酶不能在大肠杆菌中产生GLA，表明细胞色素b5结构域对于活性是重要的并且该基序的改变将导致3酶活性的降低。尽管Δ 5去饱和酶相对普通并且已被很好地描述，但依然存在对在能制造 PUFA的生产宿主细胞中以高水平有效表达的酶的需求。因此，有待解决的问题是发现适合在商业上有用的宿主细胞中整合到PUFA生物合成途径的、具有高活性的新的Δ 5去饱和酶。通过意料之外的发现，即在多种Δ 5去饱和酶的细胞色素b5结构域的HPGG基序中的改变，导致了以DGLA向ARA的转化计最高38%的酶活性升高，申请人已解决了上述问题。专利技术概述本专利技术涉及编码具有△ 5去饱和酶活性的多肽的新的遗传构建体，以及它们在细菌、酵母、藻类、眼虫、原生藻菌(stramenopiIes)、卵菌和真菌中用于生产PUFA的使用。相应地，本文提供具有Δ5去饱和酶活性的突变多肽，所述多肽包含选自下列的氨基酸基序SEQ ID NO :183 (HiS-Gly-Gly-Gly 或HGGG)、SEQ ID NO 184 (His-His-Gly-Gly 或 HHGG)、SEQ ID NO :186 (His-Cys-Gly-Gly 或 HCGG)、SEQ ID NO :187 (His-Trp-Gly-Gly 或HWGG)和SEQ ID NO :185 (His-Pro-Gly-Ser或HPGS)。优选的突变Δ 5去饱和酶多肽， 是与突变体所源自的亲本多肽的二高-Y -亚麻酸向花生四烯酸的转化效率相比，表现出更高的二高-Y -亚麻酸向花生四烯酸的转化效率的那些。在第二实施方案中，本文提供了基本上编码本专利技术的多肽的分离的核酸分子。在第三实施方案中，本专利技术提供了表达本专利技术的多肽的微生物宿主细胞。在第四实施方案中，本专利技术提供了用于生产花生四烯酸的方法，所述方法包括使表达权利要求1的多肽的微生物宿主细胞在二高-Y-亚麻酸的存在下生长，其中二高-Y -亚麻酸被转化为花生四烯酸。在第五实施方案中，本专利技术提供了用于生产二十碳五烯酸的方法，所述方法包括使表达权利要求1的多肽的微生物宿主细胞在二十碳四烯酸的存在下生长，其中二十碳四烯酸被转化为二十碳五烯酸。附图简述和序列表图IA和图IB示出了 ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径，并且当考虑下文对该途径的描述时应一起观看。图2提供了下列的质粒图谱(A)pDMW369 ；和(B)pZUF17。根据下面的详细描述和附带的序列描述可以更充分地理解本专利技术，下面的详细描述和附带的序列描述形成了本申请的一部分。下面的序列遵循37C. F. R. § 1. 821-1. 825 (“对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求一序列规则”("Requirements for Patent Applications Containing Nuceotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures-the Sequence Rules”))，并且符合世界知识产权组织(World Intellectual Property Organization) (WIPO) ST. 25标准(1998)以及EPO和PCT的序列表要求(规贝丨J 5. 2和49. 5 (a-bis)以及行政指令(Administrative Instructions)的208节和附录C)。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C. F. R. § 1. 822中所列出的规定。SEQ ID NO :7-19、58、97-100、139、140 和 179-195 为编码基因或蛋白质(或其部分)或质粒的0RF，如表1中所示。表1 核酸和蛋白质SEQ ID编号摘要说明核酸蛋白质序列标识号序列标识号富含组I酸的(His-rich)基序H(X)3H--1富含组氨酸的(His-rich)基序:H(X)4H—2富含组氨酸的(His-rich)基序H(X)2HH—3富含组氨酸的(His-rich)基序H(X)3HH4富含组氨酸的(His-rich )基序(H/Q)(X)2HH—5富含组氨酸的(His-rich )基序(H/Q)(X)3HH—6小目艮虫 (Euglena gracilis ) Δ5去子色禾口酵7 ( 1350bp)8 ( 449AA )("EgD5")来源于小眼虫的合成Δ5去饱和酶，其经密本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．具有Δ５去饱和酶活性的突变多肽，所述多肽包含选自下列的氨基酸基序：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８３（ＨＧＧＧ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８４（ＨＨＧＧ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８６（ＨＣＧＧ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８７（ＨＷＧＧ）和ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８５（ＨＰＧＳ）。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：Q·朱，
申请(专利权)人：纳幕尔杜邦公司，
类型：发明
国别省市：US
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