一种突变型Taq酶及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种突变型Taq酶，还公开该酶的制备方法。本发明专利技术采用现代基因工程技术，将天然Taq酶氨基酸序列中的多个位点的氨基酸进行突变，具体为将天然Taq酶的第626位由谷氨酸突变为赖氨酸，第661位由丙氨酸突变为谷氨酸，第665位由异亮氨酸突变为苏氨酸，第667位由苯丙氨酸突变为亮氨酸，第707位由异亮氨酸突变为亮氨酸，并经重组表达后得到突变型Taq酶。该突变型Taq酶与未经改造的野生型Taq酶相比，上述定点突变使得酶的活性和热稳定性均有较大的提高，使其可更加适应工业生产及科研应用需求。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种突变型Taq酶，还公开该酶的制备方法。本专利技术采用现代基因工程技术，将天然Taq酶氨基酸序列中的多个位点的氨基酸进行突变，具体为将天然Taq酶的第626位由谷氨酸突变为赖氨酸，第661位由丙氨酸突变为谷氨酸，第665位由异亮氨酸突变为苏氨酸，第667位由苯丙氨酸突变为亮氨酸，第707位由异亮氨酸突变为亮氨酸，并经重组表达后得到突变型Taq酶。该突变型Taq酶与未经改造的野生型Taq酶相比，上述定点突变使得酶的活性和热稳定性均有较大的提高，使其可更加适应工业生产及科研应用需求。【专利说明】
本申请涉及生物
，具体地，涉及。
技术介绍
1969年在美国黄石国家森林公园火山温泉中分离得到一种水生栖热菌(Thermusaquaticus)YT_l，它生长在70°C _75°C极富含矿物质的环境中。1976年，A.Chien从中分离纯化到了耐热的Taq DNA聚合酶(简称，Taq酶)。随着PCR技术的推广和应用，对Taq DNA聚合酶性质的研究日渐重要。RandallK.Saiki首度将其应用于PCR技术，使得PCR过程实现了自动连续循环。Taq DNA聚合酶是一种耐热的DNA聚合酶，属于DNA聚合酶I家族。酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，分子量为94kD。在70_75°C时具有最高的生物学活性。在92.5°C酶活性可持续130min，95°C持续40min，97.5°C 5_6min可保持约50%的酶活性。然而，随着医药科技的发展，对聚合酶性能的要求不断提高，原有的野生型TaqDNA聚合酶已经不能满足特殊PCR技术的要求了，如用于功能基因的定点突变技术要求聚合酶具有较高的热稳定性等等。由于原有Taq DNA全酶结构上的缺陷，使其在许多应用领域受到限制。因此需要对天然Taq进行进一步的改造来改善Taq DNA聚合酶的耐热性等，以适应工业生产及科研应用需求。
技术实现思路
本申请的目的在于提供一种突变型Taq酶，此外本申请还提供该突变型Taq酶的制备方法。`根据上述目的，本申请提供一种突变型Taq酶，其氨基酸序列为SEQ N0.2所示。本申请还进一步公开了可编码上述突变型Taq酶的核苷酸序列。具体的，上述核苷酸序列可为SEQ ID N0.1所示核苷酸序列。上述核苷酸序列还可为SEQ ID N0.1所示核苷酸序列进行I个或几个核苷酸取代而得到的密码子同义突变的核苷酸序列。本申请提供了一种载体，该载体包含可编码上述突变型Taq酶的核苷酸序列。具体的,上述载体包含SEQ ID N0.1所示核苷酸序列。该载体可进一步由可编码上述突变型Taq酶的核苷酸序列与表达载体经重组得到。所述表达载体为含有转录和翻译插入的编码序列所需的元件的空载体。上述表达载体可为pET_32a等。具体的，上述载体可由SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列插入pET_32a等表达载体经重组得到。本申请还进一步提供了一种重组细胞，该重组细胞可包含编码上述突变型Taq酶的核苷酸序列。具体的，该重组细胞包含SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。该重组细胞可包含载体，该载体包含编码上述突变型Taq酶的核苷酸序列。具体的,该重组细胞包含载体,该载体包含SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。该重组细胞可包含载体，该载体可由编码上述突变型Taq酶的核苷酸序列与表达载体经重组得到。具体的，该重组细胞可包含载体，该载体可由SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列与表达载体经重组得到。具体的，所述表达载体可为pET_32a等。进一步具体的，该重组细胞包含的载体为:SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列插入pET-32a等表达载体经重组得到的载体。上述重组细胞的宿主细胞可为BL21等。本申请还提供了上述突变型Taq酶的制备方法，其包括:( I)构建含有可编码上述突变型Taq酶的核苷酸序列的载体；(2)将步骤(1)的载体转化宿主细胞获得重组细胞； (3)培养并收集重组细胞，纯化提取突变型Taq酶。本申请还公开了一种聚合酶试剂，所述聚合酶试剂中含有上述突变型Taq酶。本申请同时公开了上述突变型Taq酶在PCR中的应用。本申请的有益效果是:本申请得到的突变型Taq酶其酶学性能表现经过验证，与未经改造的野生型Taq酶相比，热稳定性有明显的提高。且在低浓度模板的检测中，突变型Taq酶的活性明显高于未经改造的野生型Taq酶。本申请提供的突变型Taq酶可极大程度满足不断提高的工业及研究应用需求。【专利附图】【附图说明】图1为本申请实施例3中检测Taq酶蛋白的大小和纯度的SDS-PAGE蛋白电泳图；图2为本申请实施例4中荧光定量PCR检测突变型Taq酶和野生型Taq酶活性的对比图；图3为本申请实施例4中荧光定量PCR检测突变型Taq酶和野生型Taq酶在37 °C恒温条件下存放0天和7天的稳定性的对比图。【具体实施方式】本申请采用现代基因工程技术，将天然Taq酶氨基酸序列中的多个位点的氨基酸进行同时突变，并经重组表达后得到突变型Taq酶。该突变型Taq酶与未经改造的野生型Taq酶相比,上述定点突变使得酶的活性和热稳定性均有较大的提高,使其可更加适应工业生产及科研应用需求。本申请中，上述突变涉及天然Taq酶的以下位点:E626、A661、I665、F667和1707。在本申请的一种实施方式中，其突变型Taq酶的氨基酸序列如SEQ IDN0.2所示，包括了上述5个位点的突变，具体为将天然Taq酶的第626位由谷氨酸突变为赖氨酸，第661位由丙氨酸突变为谷氨酸，第665位由异亮氨酸突变为苏氨酸，第667位由苯丙氨酸突变为亮氨酸，第707位由异亮氨酸突变为亮氨酸。本申请还进一步提供了可编码上述突变型Taq酶的核苷酸序列。具体的，在本申请的一个实施例中，公开了 SEQ ID N0.1所示核苷酸序列。本领域技术人员可根据现有分子生物学技术，采用cDNA克隆和定点突变的方法或其他适合的方法获得本申请的突变型Taq酶的核苷酸序列。这里还需说明的是，编码上述突变型Taq酶的核苷酸序列并不仅限于SEQID N0.1所示的核苷酸序列。本领域技术人员熟知，同一氨基酸可由几种不同的密码子来决定，故同一氨基酸可对应不同的核苷酸序列。因此本申请中的突变型Taq酶的氨基酸序列，即SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列，除可由SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列所编码，也可由SEQ ID N0.1所示核苷酸序列进行I个或几个核苷酸取代而得到的密码子同义突变的核苷酸序列所编码。本领域技术人员可以根据本申请公开的突变型Taq酶的氨基酸序列，得到可编码该酶的核苷酸序列。本申请同时公开了制备上述突变型Taq酶的方法。其制备方法包括以下步骤:(I)构建含有可编码上述突变型Taq酶的核苷酸序列的载体；(2)将步骤(1)的载体转化宿主细胞获得重组细胞；(3)培养并收集重组细胞，纯化提取突变型Taq酶。其中构建载体这一步骤可以采用先合成可编码上述突变型Taq酶的核苷酸序列，再将该核苷酸序列插入到适当的表达载体中。也可通过PCR直接得到包含突变型Taq酶的质粒，在本申请的一个实施例中，用包含天然Taq酶(野生型Taq酶)基因的质粒做模板，进行PCR扩增。合成的扩增引本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种突变型Taq酶，其特征在于，所述突变型Taq酶的氨基酸序列为SEQNO.2所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：范凌云，李泓彦，邓艳华，
申请(专利权)人：深圳市菲鹏生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：