HIV-1B亚型耐药突变株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种HIV-1B亚型耐药突变株及其构建方法和应用。本发明专利技术提供的的方法，是将HIV-1B亚型野生株的逆转录酶自N末端第369位氨基酸残基由苏氨酸突变为缬氨酸，获得HIV-1B亚型耐药突变株。本发明专利技术对于抗HIV药物的筛选具有重大价值，进而对艾滋病的治疗具有深远影响。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种HIV-IB亚型耐药突变株及其构建方法和应用。
技术介绍
人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)是引起人类获得性免疫缺陷综合征(Acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)的病原体，自 1981 年美国首次诊断出艾滋病以来，艾滋病在全球范围内迅速传播。中国艾滋病的流行已有25年，截止2010年10月底，中国已累计报告艾滋病病毒感染者和艾滋病患者37万余例，其中艾滋病病人已逾13万之多，仅死亡病例就已超过6. 8万。在国家“四免一关怀”政策的支持下，我国从2003年开始在全国范围内逐步实施免费的艾滋病抗病毒治疗，到2010年底治疗人数已超过7万人。临床观察表明，抗病毒治疗对减轻病情、提高病人生活质量、延长生命具有很好的作用。但抗病毒治疗也是一把“双刃剑”，在为病人带来福音的同时也为进一步的治疗带来了困难——HIV耐药性的出现与流行成了制约抗病毒治疗的瓶颈。HIV-I抑制剂主要是针对蛋白酶和逆转录酶设计而成，目的是阻断HIV-I的复制和包装。尽管目前已经确定了大量HIV耐药突变位点，但是仍然不断有新型耐药突变位点被发现和鉴定，原因是(1)以往对耐药突变位点的研究主要集中于药物与病毒靶标的结合区，近年来发现，药物压力对病毒的影响是长期的、整体的，在药物结合区以外也有耐药相关突变位点；( 病毒长期处于药物压力下，宿主/病毒/药物长期相互作用，病毒将出现比初期受到药物压力时更多耐药相关突变；C3)不同亚型HIV-I毒株在相同的药物压力下可能出现不同的耐药突变或突变型。新型耐药突变位点的发现及鉴定对抗病毒治疗以及了解耐药机制都具有至关重要的意义。中国于2003年在既往有偿采浆感染HIV的艾滋病人群中首推使用6种国产仿制抗病毒药物(Zidovudine，简称AZT或ZDV，中文名称为齐多夫定；Dideoxyinosine，简称ddl，中文名称为去羟肌苷Jtavudine，简称d4T，中文名称为司他夫定；Lamivudine，简称3TC，中文名称为拉米夫定；Nevirapine，简称NVP，中文名称为奈韦拉平；Efavirenz，简称EFV,中文名称为依非韦仑)组成的AZT/ddl/NVP、AZT/3TC/NVP等6种治疗方案，之后在全国范围内全面推广。我国的抗病毒治疗模式存在以下特点(1)目前的抗病毒治疗主要使用国产仿制药，尽管药物的主要成分与国外的药物相同，但生产工艺的细小差别也可能影响药物的效果，例如在有些地区发现毒副作用可能较大，这可能直接影响药物的吸收以及血药浓度，对耐药性产生有重要影响；( 抗病毒治疗模式是以农村为主的依托乡村医生的治疗，服药的治疗和保障方式均有特点；C3)在河南等地区，由于对抗病毒治疗认识上的不足和缺乏必要的临床药物服用监督，药物依从性不能达到一个理想的水平，而依从性是影响耐药发生的一个至关重要的因素，在一些地区耐药发生已经到了相当严重的地步。虽然艾滋病病毒在我国流行呈多样性，但在我国以既往献/输血感染HIV的边远农村地区，HIV-IB亚型毒株依然占主导地位。抗病毒治疗时间长及上述抗病毒模式的特点，提示在HIV-IB亚型毒株中可能会存在有尚未被认知的新型耐药突变。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种HIV-IB亚型耐药突变株及其构建方法和应用。本专利技术提供了一种构建HIV-IB亚型耐药突变株的方法，是将HIV-IB亚型野生株的逆转录酶自N末端第369位氨基酸残基由苏氨酸(T)突变为缬氨酸(V)，获得HIV-IB亚型耐药突变株(HIV-1B亚型T369V突变株)。所述HIV-IB亚型野生株的逆转录酶的氨基酸序列如序列表的序列1所示。所述将HIV-IB亚型野生株的逆转录酶自N末端第369位氨基酸残基由苏氨酸突变为缬氨酸具体是通过将HIV-IB亚型野生株的逆转录酶的编码基因自5’末端第1105位核苷酸由a突变为g，第1106位核苷酸由c突变为t实现的；所述HIV-IB亚型野生株的逆转录酶的编码基因如序列表的序列2所示。所述HIV-IB亚型耐药突变株对药物的耐受能力高于所述HIV-IB亚型野生株；所述药物为AZT(Zidovudine，又称齐多夫定)、EFV(Efavirenz ；又称依非韦仑)和NVP(Nevirapine，又称奈韦拉平)中的至少一种。所述将HIV-IB亚型野生株的逆转录酶自N末端第369位氨基酸残基由苏氨酸突变为缬氨酸的方法具体包括如下步骤(1)将pNL4. 3质粒中的所述HIV-IB亚型野生株的逆转录酶的编码基因自5’末端第1105位核苷酸由a突变为g，第1106位核苷酸由c突变为t，获得重组质粒pNL4. 3_T369V ；(2)将重组质粒pNL4. 3_T369V转染哺乳动物细胞，培养细胞并收获上清液。所述哺乳动物细胞具体可为细胞。所述培养的方法具体可为37°C培养18-4他。以上任一所述方法获得的HIV-IB亚型耐药突变株也属于本专利技术的保护范围。所述HIV-IB亚型耐药突变株可用于筛选抗艾滋病药物。本专利技术还保护一种重组质粒，为将pNL4. 3质粒中的HIV-IB亚型野生株的逆转录酶的编码基因自5’末端第1105位核苷酸由a突变为g，第1106位核苷酸由c突变为t，获得的重组质粒PNL4. 3_T369V ；所述HIV-IB亚型野生株的逆转录酶的编码基因如序列表的序列2所示。本专利技术还保护T369V突变在促进HIV-IB亚型野生株的耐药性中的应用；所述T369V突变为HIV-IB亚型野生株的逆转录酶自N末端第369位氨基酸残基由苏氨酸(T)突变为缬氨酸(V)。所述逆转录酶的氨基酸序列如序列表的序列1所示。本专利技术对于抗HIV药物的筛选具有重大价值，进而对艾滋病的治疗具有深远影响。附图说明图1为重组质粒pNL4. 3_T369V的Hind III酶切鉴定图；泳道6 重组质粒pNL4. 3_T369V ；泳道10 分子量Marker ；其它泳道与本专利无关。图2为HIV-IB亚型T369V突变株感染MT_2细胞后的CPE效应(普通光学显微镜下的数码照片，物镜放大倍数为IOX，目镜放大倍数为10X)；箭头指示的为合胞体。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。pMD-18 T 载体TaKaRa 公司。AZT (Zidovudine) =SIGMA0 EFV(Efavirenz)上海迪赛诺公司。NVP(Nevirapine)上海迪赛诺公司。Phusion Site-directed MutagenesisKit 购自 New England Biolabs, Product Code :F541，用于 DNA 序列的定点突变。Lipofectamine 2000 购自 Invitrogen，Cat No :11668_019。实施例1、耐药突变位点的发现比较抗病毒治疗失败患者与未治疗患者蛋白全长基因的序列，在逆转录酶区的560个密码子中，2组人群中共计有6个位点的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李韩平，李敬云，耿庆茂，郭伟，鲍作义，李林，刘永健，庄道民，刘思扬，李天一，王晓林，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所，
类型：发明
国别省市：